一、DNA改组及其应用（论文文献综述）
韩增鹏[1]（2020）在《基于定向进化和理性化设计的AAV载体改造》文中研究表明腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）是细小病毒科的一类无囊膜、具有二十面体结构、嗜性广泛的单链DNA病毒,作为高效安全的转基因载体,被广泛用于基因治疗、神经环路标记、活体成像、基因编辑以及神经系统疾病动物模型的制备等方面。尽管AAV应用广泛,但仍存在着对于特定组织细胞的转导能力差和穿透血脑屏障效果不佳等缺点。本文在系统地了解不同自然血清型AAV的嗜性基础上,基于定向进化及理性化设计的策略针对AAV的衣壳结构基因Cap设计突变文库,作为对文库筛选范式的验证,我们以“获得高效跨血脑屏障的AAV突变体”作为初步的筛选目标。首先,自然血清型的AAV是优化改造工作的基础,为了给后续的衣壳优化工作提供参照标准,我们分别包装了 13种自然血清型的AAV,并初步进行了细胞水平的感染特性探究,发现AAV6、AAV2、AAV1等血清型对多种细胞系均表现出较佳的感染效果,尤其是AAV6对神经胶质细胞系表现出更好的感染特性,这启示我们未来在靶向神经胶质细胞的AAV载体改造中,AAV6或可作为首选的模板血清型;其次,为了优化用于装载Cap基因文库进而制备AAV病毒文库的质粒系统,我们设计了 5种包装质粒方案,通过实验对比,发现pAAV-ITR-P41-lox Cap核心质粒配合Rep2-AAP辅助质粒的方案包装效果最优,因此将该方案用于后续突变体文库的包装;然后,基于定向进化和理性化设计的方法,兼顾文库丰度的同时,围绕“获得高效跨血脑屏障的AAV突变体”这一筛选目标有侧重地引入理性化因素以降低基因文库的冗余度,从而设计和制备Cap基因文库,并将Cap基因文库装载到先前验证的pAAV-ITR-P41-lox Cap核心质粒上,构建了基于DNA改组方法的pAAV-Shuffling质粒文库、基于多肽展示方法的pAAV-PD文库（约包含11810种突变体）和基于理性化设计的19种pAAV-ZH系列质粒;最后,将质粒文库和辅助质粒共转染HEK293T细胞系,包装获得了基于多肽展示方法AAV-PD病毒文库（3.14×1012 VG/ml）与19种AAV-ZH突变体,对比不同突变体的包装滴度,证实了在AAV衣壳中插入的外源肽段长度越长越不利于病毒粒子包装,在细胞水平评估实验中对神经胶质瘤细胞（U87）表现出感染性的ZH05、ZH06突变体或有进一步研究的价值。这些研究工作初步建立了基于DNA改组、多肽展示等成熟的定向进化技术构建AAV突变体文库的系统范式,制备了可用于后续筛选的AAV病毒文库和若干AAV突变体,为后续更进一步的突变体文库构建和广泛的突变体筛选奠定了初步的基础。
王杰[2]（2019）在《一种高效的多点组合突变方法的构建与应用》文中研究指明生物催化剂与传统化学催化剂相比较,具有高度的专一性和高效的催化能力,被广泛应用于合成复杂药物中间体、精细化学品等。天然酶缺乏商业酶制剂应用所需的特性,而不断发展的定向进化技术结合高质量的诱变方法和高效的筛选方法,能够快速筛选出更优质的特性或新功能。定向进化是一种功能强大且广泛使用的酶工程方法。随着人们对蛋白质结构功能的深入探究,以及计算机程序和计算能力的不断提高,计算机辅助设计已经经常应用于酶工程改造。蛋白质结构功能取决于氨基酸残基之间的相互协同作用,以计算机辅助设计筛选氨基酸靶点为基础的现有的多点组合突变的定向进化诱变方法无法同时实现突变多样性和大量的克隆数,因此,需要研究开发一种新的定向进化的诱变方法对关键氨基酸位点进行组合突变。本研究开发设计了一种多点组合突变（Multi-points Combinatorial Mutagenesis,MCM）方法,该方法构建的质粒文库可以同时实现高度丰富的突变率和大量克隆数。首先利用DNA组装技术拼接突变目的基因;随后基因片段与载体片段经融合PCR得到两种不同位置有缺口的线性质粒片段;最后两种线性质粒体外杂交得到环状质粒分子,并转化至大肠杆菌感受态获得突变库,实现多点组合突变。通过优化融合PCR反应条件以及线性质粒杂交条件,最终电转至大肠杆菌感受态Escherichia coli TreliefTM5α所获得的单菌落数量（Colony-Forming Units,CFUs）超过 106 CFUs/μg DNA。应用优化后的MCM方法定向进化改造苯甲酰甲酸脱羧酶（Benzoylformate Decarboxylase,BFD）来测试该方法的效率。菌落PCR验证以及DNA测序结果表明:90/100个单菌落精确组装;5个位点同时组合突变的频率达到80%以上;NDT简并密码子衍生的12种可能氨基酸残基均包括在内。最后筛选到酶催化活性提高2倍的突变体（BFD-F3:L109Y,L110D,H281G,Q282V和A460M）,动力学参数测定表明突变体BFD-F3的kcat提高约6倍,最终kcat/Km为1.35 M-1 s-1,约为野生型的10倍。气相色谱-质谱法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS）检测结果表明 BFD 蛋白确实催化合成羟基乙醛。本研究课题成功构建了一种多点组合突变的定向进化诱变方法,该方法在指定的目的位点引入丰富的突变多样性,同时创建大量的克隆数覆盖突变的可能性。因此,若与计算机辅助设计方法结合,该方法可以显着提高酶工程效率,有望对定向进化技术发展产生显着的影响。
刘超[3]（2019）在《LipL41过氧化物酶的体外进化》文中进行了进一步梳理过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶,其结构大部分含有血红素辅基（铁原卟啉）。迄今为止研究最为深入的过氧化物酶是辣根过氧化物酶（HRP）,HRP具有催化活性强、酶活稳定等优点,广泛应用于生物传感器和临床诊断等领域。但是由于其价格昂贵,使用条件苛刻,制约了其在生产实践中的应用。LipL41是钩端螺旋体的主要脂蛋白,与血红素结合具有过氧化物酶活性,可与Protein G及其他功能蛋白进行融合表达,在酶联免疫吸附、电镜染色技术和半固相膜免疫信号转换等方面具有较大的应用潜力。由于LipL41过氧化物酶酶活性较低,限制了其应用。因此本试验利用定向进化技术,使目的基因随机突变和体外重组,从而构建高库容突变库,并通过基于克隆原位酶活测定的高通量筛选方法,目的提高了LipL41酶促活性,在免疫检测等领域提供了一种可溶性标记用酶。本试验首先选用易错PCR技术对LipL41基因进行随机突变,将突变基因转化到Rosetta大肠杆菌中,构建突变基因库,在LB平板上培养后喷洒酶显色底物,根据颜色深浅挑选出疑似正向突变体,经酶活测定验证,共获得9株分泌酶活较高的突变体,通过检测其酶活,发现其酶活提高率在10%-25%左右。为了进一步提高LipL41酶活,本试验利用DNA改组技术,对9株分泌高酶活突变体基因体外重组。通过筛选获得一株高酶活突变体LipL41-P101,相比野生型酶活提高1.9倍。最后对野生型和突变型酶学特性分析发现,野生型过氧化物酶热稳定性高于突变酶LipL41-P101。野生型过氧化物酶和突变酶LipL41-P101的最适反应温度均为30℃。在pH稳定性方面,pH在5-9时,野生酶相比突变酶LipL41-P101酶活稳定性较高。野生酶和突变酶LipL41-P101在pH=5时酶活稳定性最高。野生酶最适和突变酶LipL41-P101的最适pH均为6。本试验通过定向进化技术,选育出一株酶活显着提高的突变酶,为该酶的应用奠定基础。
许勇[4]（2018）在《酶的定向进化及其应用进展》文中指出酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略,主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前,突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组;高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表面展示、核糖体展示和差示荧光扫描等相关技术及其应用情况。
王松明,顾招兵,朱雅新,冷静,冯励,李清,杨舒黎[5]（2017）在《蛋白质定向进化技术概述》文中认为定向进化技术是近二十年发展起来的蛋白质改造技术,其可通过对基因的突变和重组来构建突变库,然后通过高通量的筛选鉴定性能改善的突变体,此技术是改善酶性能最有效的途径之一。本文就定向进化技术的几种常用方法和定向进化后的文库筛选、应用及展望进行了概述。
王秋文[6]（2016）在《纤维素酶基因优化及在植物乳酸杆菌中的表达》文中研究说明纤维素是一种最大天然的可循环能源,人类对其的应用已有很久的时间。合理地开发与利用纤维素资源能够有效地应对能源危机、粮食短缺、环境污染等危机。现今使用微生物及其分泌的纤维素酶来分解纤维素是一种高效并且结果显着的方式。作为一种饲料添加剂,纤维素酶具有能够显着提高饲料的消化和利用率、改善饲料品质、促进动物生产等功能,在畜牧业中有着广阔的应用前景,但由于它的酶活性低、成本高等原因,使它的不能被很好的被使用。目前,利用体外定向进化技术改造纤维素酶基因及构建高产纤维素酶的基因工程菌,已经获得研究人员的关注。本试验从能够有效产纤维素酶的菌康氏木霉（T.koningii）及黑曲霉（Aspergillus niger）的DNA文库中通过PCR获得外切葡聚糖酶CBHⅠ基因,并对其进行DNA改组,构建重组表达质粒pMG36e-CBHⅠ,并利用高压电击手段转入到植物乳酸杆菌中,实现CBHⅠ基因在植物乳酸杆菌中的表达。主要内容以下:（1）使用RT-PCR技术成功克隆得到康氏木霉黑曲霉CBHⅠ基因,两种纤维素酶基因与NCBI公布的纤维素基因同源性均大于99%。（2）对克隆得到的两种纤维素酶基因进行DNA改组,将改组纤维素酶基因与pMD19-T质粒连接并转入大肠杆菌中,得到两株纤维素酶基因改组I号（g1）和改组II号（g2）。g1在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨酸;在636位点碱基由A变为G,氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸;g2在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨;在554位点碱基由G变为A,氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸;在1114位点碱基由T变为C,氨基酸未发生变化,均为谷氨酰胺。将改组的纤维素酶基因与表达载体pMG36e连接,构建可在乳酸杆菌中表达的重组质粒载体。（3）将重组质粒载体通过电击转化转入植物乳酸杆菌中,并通过红霉素抗性筛选及质粒PCR选出重组菌,并对其分泌的纤维素酶活进行测定。结果显示,在低糖MRS培养基中,g1的滤纸酶活最高可达4.83 U/L,g2的滤纸酶活最高可达4.19 U/L;两者的最适反应温度均为50℃,g1的最适pH为5.0,g2的最适pH为5.5。
杨刚[7]（2015）在《蛋白酶基因改组和表达及其在羽毛粉酶解和肉鸡生产中的应用研究》文中研究指明随着饲料蛋白资源的日益短缺和价格飞速上涨,低质蛋白资源的开发成为研究的热点。羽毛粉蛋白质含量丰富,但其结构稳定,不溶于水,不能被一般的蛋白酶水解,难以被动物消化吸收。本文通过筛选得到对羽毛粉降解效果较好的米曲霉和枯草芽孢杆菌菌株,对两种菌株的中性蛋白酶和碱性蛋白酶基因进行DNA改组和克隆,将改组后的蛋白酶基因成功转入毕赤酵母X33中,并对重组酵母蛋白酶活力和酶学性质进行分析。最后利用重组毕赤酵母发酵羽毛粉并将其应用到肉鸡生产中,对发酵羽毛粉替代鱼粉对肉鸡的饲养效果进行研究,为缓解蛋白资源短缺和提高羽毛粉的饲用价值提供了新的技术途径。主要结果如下:（1）从五种微生物菌株中初筛出产蛋白酶活力较高的米曲霉和枯草芽孢杆菌菌株。通过测定蛋白酶活力和羽毛粉中可溶性蛋白含量,对米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果进行研究。结果显示,两种微生物菌株均可对羽毛粉起到降解作用。发酵72 h后,米曲霉产蛋白酶活力达到3256.61 U/g（P<0.05）,枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力达到690.03 U/g（P<0.05）。米曲霉发酵羽毛粉48 h时可溶性蛋白含量,由最初的2.21 mg/g提高到362.07 mg/g（P<0.05）。（2）使用RT-PCR技术,成功克隆得到米曲霉中性和碱性蛋白酶基因、枯草芽孢杆菌中性和碱性蛋白酶基因,四种蛋白酶基因与NCBI公布的蛋白酶基因同源性均大于99.5%。（3）对克隆得到的四种蛋白酶基因进行DNA改组,将改组蛋白酶基因与pMD19-T质粒连接并转入大肠杆菌中,通过酪蛋白平板筛选,得到三个来自米曲霉的DNA改组中性蛋白酶基因NPGA-S1、NPGA-S2、NPGA-S3和一个来自枯草芽孢杆菌的DNA改组中性蛋白酶基因NPGB-S1。（4）将四种DNA改组蛋白酶基因和两种中性蛋白酶基因电击转入毕赤酵母X33中,通过重组酵母蛋白酶活力测定,筛选出NPGA-S2和NPGA-S3两种改组效果较好的蛋白酶基因。（5）将NPGA-S2和NPGA-S3与四种初始蛋白酶基因一起进行第二轮DNA改组,初筛出一个来自米曲霉的中性蛋白酶DNA改组基因NPGA-S4,将其电击转化至毕赤酵母X33中,通过对三种含米曲霉中性蛋白酶改组基因的重组毕赤酵母产蛋白酶酶活力的测定,最终选出NPGA-S2作为最好的DNA改组蛋白酶基因。与初始蛋白酶基因相比,DNA改组蛋白酶基因在1022 bp处的核苷酸T突变为C,相应的氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸。DNA改组蛋白酶的酶活力比初始蛋白酶活力提高36.4%（P<0.05）,pH和热稳定性也得到了明显提高,在pH6.5-8.0和30-70℃之间保持稳定（P<0.05）。（6）通过鸡强饲试验对发酵羽毛粉蛋白质、钙和磷代谢率进行测定,米曲霉和含蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉的蛋白质和钙磷表观代谢率显着高于普通羽毛粉和不含蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉（P<0.05）。与普通羽毛粉相比,发酵羽毛粉（含玉米）中各种氨基酸含量均有所提高,含改组蛋白酶基因的重组酵母发酵羽毛粉赖氨酸含量增长接近1倍。（7）用米曲霉和含蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉替代鱼粉添加到肉鸡日粮中,通过测定黄羽肉鸡生长性能、屠宰性能、肉品质、肠道微生物、血液生化指标和经济效益分析,研究发酵羽毛粉替代鱼粉对肉鸡生产的可行性。饲养试验分为前期（1-28d）和后期（29-56d）两个阶段。前期和后期分别选择250只黄羽肉鸡,分为五个处理,每个处理5个重复,每个重复10只鸡。其中A组为含鱼粉的基础日粮（对照组）,B组用等量米曲霉发酵羽毛粉替代基础日粮中的鱼粉,C组用等量不含蛋白酶基因的pGAPZαA重组毕赤酵母发酵羽毛粉替代基础日粮中鱼粉（负对照组）,D组用等量含米曲霉蛋白酶基因的pGAPZαA重组毕赤酵母发酵羽毛粉替代基础日粮中鱼粉,E组用等量含米曲霉DNA改组蛋白酶基因（NPGA-S2）的pGAPZαA重组毕赤酵母发酵羽毛粉替代基础日粮中鱼粉。结果表明,饲养试验前期和后期,除负对照组外,添加米曲霉和含蛋白酶基因发酵羽毛粉各组和对照组在日增重、日采食量、饲料转化率和营养物质代谢率方面差异不显着（P>0.05）。含DNA改组蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉组屠宰率、全净膛率和肉品质虽然高于其他各组,但各组之间差异不显着（P>0.05）。米曲霉和含蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉组肠道蛋白酶活力显着高于对照组和负对照组（P<0.05）。各组在肠道微生物数量、肠道微生物菌群分布和微生物多样性方面基本一致,其中含DNA改组蛋白酶基因重组酵母发酵羽毛粉组对肠道微生物生长和稳定有促进作用。除对照组外,各组血清中总蛋白、球蛋白和白蛋白差异不显着（P<0.05）,添加发酵羽毛粉对肉鸡血清酶活和免疫系统无明显影响。另外,经济效益分析也证明,使用发酵羽毛粉替代鱼粉饲喂肉鸡是可行的,为羽毛粉等非常规蛋白质饲料资源的开发和利用奠定基础。
张志来,陈建华[8]（2014）在《定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展》文中研究说明定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复改造遗传多样性,结合文库高通量筛选而获得理想性状生物体的过程,现已成为在基础生物学和应用生物学领域应用最广泛和最有效的技术之一。目前已成功应用于蛋白质的研究和开发。蛋白质在生物催化、生物医药等领域具有广泛的应用。如何提高目的蛋白的产量、改善蛋白质的理化特性以及构建具有新催化活性的蛋白质以满足日益增长的需求是亟待解决的问题。而定向进化技术的发展为实现这样的目的提供了
任春梅[9]（2014）在《南极假丝酵母脂肪酶B的分子改造及其应用》文中研究指明南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在水相和非水相介质中都表现出较高的催化活性,是应用最为广泛的生物催化剂之一,可以催化水解、酯化、聚合、转酯化等反应。CALB催化具有活性高、选择性好、反应条件温和、对环境友好以及催化底物谱广等优势,使其成为国内外研究的热点。目前它已广泛应用于手性药物中间体的拆分、酯类产品合成、油脂改性以及生物柴油合成等领域。关于南极假丝酵母脂肪酶B的结构、克隆与表达、固定化以及分子改造等研究已广泛开展。近来,对CALB进行定向进化和探索其新的应用正是研究的热点问题。本论文从实验室已构建成功的工程菌南极假丝酵母脂肪酶B（E.coli JM109/pPICZαA-CALB）出发,利用理性设计方法对其进行分子改造。对CALB的立体结构进行分析,发现其D134、1189、V190、V221、A281位点具有一定特殊意义。以pPICZαA-CALB载体为模板,设计兼并引物,采用质粒扩增诱变方法,对原始菌株进行D134、1189、V190位点的第一轮定点突变,然后在V190L的基础上进行第二轮221、281位点的饱和突变。突变后均获得约4500 bp的重组突变质粒库,最终导入毕赤酵母X-33中表达,重新构建得到毕赤酵母重组CALB 突变株（Pichia pastoris X-33/pPICZα A-CALBmut）。经过p-NPA法测定各突变脂肪酶的水解酶活,得到若干株活力提高的突变菌。选择对p-NPA水解活力提高最多的突变株D-4（A281G/V190L）,对其进行分离纯化及酶学性质研究。研究结果表明D-4最适反应pH、温度分别为7.0、35℃,该酶在pH5～10范围内比较稳定,但对高温较为敏感。部分金属离子对酶活具有轻微促进作用,Mn2+几乎不影响此酶的活性,但Fe2+对酶具有完全抑制作用。除TritonX-100对酶活力有轻微的激活作用,其他表面活性剂（SDS、吐温-80、吐温-20、山梨醇）均抑制该酶的活性。选用四个突变菌株 V190L,281-1-1（A281T/V190L）,281-11-2（A281V/V190L）,D-4及原始菌株（WT）为研究对象,分别检测其在不同反应类型中的催化性能。突变前后CALB针对对硝基苯酚酯（p-NPs）的底物特异性水解研究中发现:D-4对短中链（C2-C6）的p-NPs水解活力最高,其中对p-NPB、p-NPA的水解活力分别比WT活力提高了 60倍、41倍,而281-1-1对长链p-NPs的水解活力最好。在酯化合成维生素A棕榈酸酯研究中,只有V190L活力提高了 145%,D-4酯化活力几乎没有发生改变。从水解拆分3-氰基-5-甲基-己酸酯研究中可知,突变菌的活力均有不同程度提高;突变菌除了对3-氰基-5-甲基-己酸甲酯的选择性有所降低外,对其他底物的选择性均有提高。WT对3-氰基-5-甲基-己酸正戊酯完全没有选择性,而D-4对其具有一定的选择性,E值达到12.8。
潘素晶,徐增辉,张悦,钱其军[10]（2013）在《DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用》文中研究表明DNA改组（DNA shuffling）是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒（adenoassociated virus,AAV）是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.
二、DNA改组及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA改组及其应用（论文提纲范文）
（1）基于定向进化和理性化设计的AAV载体改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 腺相关病毒载体的生物学特性及制备方法 |
| 1.2 腺相关病毒载体在基因治疗及基础科学研究中的应用 |
| 1.3 腺相关病毒载体衣壳蛋白的改造 |
| 1.4 本课题的研究内容 |
| 第2章 自然血清型AAV的感染特性验证 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 构建含有AAV包装元件的穿梭质粒 |
| 2.2.2 鉴定与抽提重组杆粒 |
| 2.2.3 重组杆粒转染Sf9细胞制备杆状病毒载体 |
| 2.2.4 BEV感染Sf9细胞制备AAV |
| 2.2.5 AAV病毒的纯化 |
| 2.2.6 AAV包装滴度的测定 |
| 2.2.7 AAV纯化病毒样品凝胶银染 |
| 2.2.8 AAV病毒粒子的电镜检测 |
| 2.2.9 细胞培养 |
| 2.2.10 测定AAV在细胞水平的转导效率 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒样品滴度测定及凝胶银染 |
| 2.3.2 自然血清型AAV电镜检测结果 |
| 2.3.3 自然血清型AAV在不同细胞系中的感染效果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 AAV文库包装质粒的设计与验证 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 用于AAV文库包装的核心质粒的设计 |
| 3.1.2 用于AAV文库包装的Rep辅助质粒的设计 |
| 3.1.3 包装质粒方案总结及分子构建路线 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 基因片段合成及亚克隆构建包装质粒 |
| 3.2.2 引物合成 |
| 3.2.3 碱裂解法小量抽提质粒DNA |
| 3.2.4 PCR扩增目的基因 |
| 3.2.5 琼脂糖凝胶回收DNA |
| 3.2.6 寡核苷酸退火 |
| 3.2.7 酶切、连接 |
| 3.2.8 感受态细胞的制备 |
| 3.2.9 质粒转化大肠杆菌及鉴定 |
| 3.2.10 碱裂解法大量抽提质粒DNA |
| 3.2.11 质粒转染HEK293细胞包装AAV病毒 |
| 3.2.12 细胞蛋白提取和样品制备 |
| 3.2.13 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.2.14 AAV病毒粗纯及细胞感染 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 获得AAV文库包装质粒 |
| 3.3.2 不同包装方案里病毒蛋白的表达效果 |
| 3.3.3 由不同包装方案所获得病毒粒子的包装效果 |
| 3.3.4 由不同包装方案所获得病毒的细胞感染效果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 AAV Cap基因质粒文库的制备 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.1.1 基于DNA改组方法的Cap基因突变文库 |
| 4.1.2 基于多肽展示方法的Cap基因突变文库 |
| 4.1.3 基于理性化设计的Cap基因突变体 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 引物合成 |
| 4.2.2 Donor质粒的构建 |
| 4.2.3 PCR扩增目的基因 |
| 4.2.4 DNase I随机切割DNA片段 |
| 4.2.5 DNA改组 |
| 4.2.6 交错延伸(StEP)PCR |
| 4.2.7 构建pAAV-Shuffling质粒文库 |
| 4.2.8 构建pAAV-ITR-P41-lox Cap9-NheI |
| 4.2.9 构建pAAV-PD质粒文库 |
| 4.2.10 构建pAAV-ZH系列质粒 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 获得pAAV-Shuffling质粒文库 |
| 4.3.2 获得pAAV-ITR-P41-lox Cap9-NheI质粒 |
| 4.3.3 获得pAAV-PD质粒文库 |
| 4.3.4 获得pAAV-ZH系列质粒 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 AAV病毒文库的包装与初步评估 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 AAV病毒文库包装、纯化及滴度测定 |
| 5.2.3 AAV突变体细胞系感染实验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 获得AAV-ZH系列突变体和AAV-PD文库 |
| 5.3.2 AAV-ZH突变体细胞系感染效果 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）一种高效的多点组合突变方法的构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 定向进化 |
| 1.2 定向进化建库策略 |
| 1.2.1 随机突变 |
| 1.2.2 同源重组 |
| 1.2.3 非同源重组 |
| 1.2.4 蛋白质半理性/理性设计 |
| 1.2.5 连续进化 |
| 1.3 定向进化筛选策略 |
| 1.3.1 常用的筛选方法 |
| 1.3.2 表面展示技术 |
| 1.3.3 核糖体与mRNA展示技术 |
| 1.3.4 流式细胞分选技术 |
| 1.3.5 体外隔室 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和工具酶 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 2.1.3 培养基及常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA提取 |
| 2.2.3 PCR反应体系及反应条件 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 DMT消化反应 |
| 2.2.6 PCR产物回收 |
| 2.2.7 切胶回收 |
| 2.2.8 转化 |
| 2.2.9 菌落PCR验证 |
| 2.2.10 蛋白质的表达纯化 |
| 2.2.11 蛋白质浓度测定 |
| 2.2.12 高效的多点组合突变方法构建质粒文库 |
| 2.2.13 苯甲酰甲酸脱羧酶突变体酶活性分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 高效多点组合突变质粒文库构建方法的设计思路 |
| 3.2 高效多点组合突变质粒文库构建方法验证及优化 |
| 3.2.1 多点组合突变 |
| 3.2.2 靶向目的基因bfd与载体pET-28a的融合PCR组装优化 |
| 3.2.3 线性质粒pET-28a-bfd杂交组装优化 |
| 3.3 高效的多点组合突变方法构建质粒文库的应用 |
| 3.3.1 构建苯甲酰甲酸脱羧酶质粒文库 |
| 3.3.2 菌落PCR验证及DNA测序分析 |
| 3.3.3 突变体筛选 |
| 3.3.4 蛋白纯化及动力学参数测定 |
| 3.3.5 羟基乙醛的定性分析 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
| 附录 |
（3）LipL41过氧化物酶的体外进化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 定向进化 |
| 1.1.1 突变文库的构建方法 |
| 1.1.2 突变文库的筛选方法 |
| 1.1.3 定向进化的应用 |
| 1.2 过氧化物酶的研究概况 |
| 1.2.1 过氧化物酶的结构及分类 |
| 1.2.2 过氧化物酶的应用 |
| 1.2.3 LipL41 蛋白研究概况 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 第二章 LipL41 基因通过易错PCR构建随机突变库及筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 试剂盒和工具酶 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌菌种活化及质粒的提取 |
| 2.2.2 易错PCR扩增LipL41 基因 |
| 2.2.3 突变库的构建 |
| 2.2.4 高通量筛选方法的构建 |
| 2.2.5 酶活测定 |
| 2.2.6 阳性克隆的酶切验证 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 LipL41 基因的易错PCR反应 |
| 2.3.2 目的基因与载体p ET-22b(+)的双酶切 |
| 2.3.3 高通量筛选条件的优化结果 |
| 2.3.4 突变库的筛选及筛选结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 利用DNA改组技术提高LipL41 过氧化物酶酶活 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 试剂盒和工具酶 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 常用试剂 |
| 3.1.5 培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 DNA改组实验方法 |
| 3.2.2 突变库的构建 |
| 3.2.3 LipL41 过氧化物酶的高酶活筛选 |
| 3.2.4 突变酶酶学性质的考察 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 正向突变株基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 DNA改组结果 |
| 3.3.3 突变库的构建及菌株检测结果 |
| 3.3.4 野生酶和突变酶的酶学特性分析结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）酶的定向进化及其应用进展（论文提纲范文）
| 1 酶突变文库的构建手段 |
| 1.1 随机突变 |
| 1.2 半理性设计 |
| 1.3 DNA改组 |
| 2 高通量筛选方法 |
| 2.1 表面展示技术 |
| 2.3 差示荧光扫描 (differential scanning fluorimetry, DSF) |
| 3 结论与展望 |
（5）蛋白质定向进化技术概述（论文提纲范文）
| 1 定向进化方法 |
| 1.1 易错PCR |
| 1.2 DNA改组 |
| 1.3 交错延伸重组 |
| 1.4 体外随机引发重组 |
| 1.5 渐增切割法产生杂和酶 |
| 1.6 酵母增强组合文库 |
| 1.7 过渡模板随机嵌合生长技术 |
| 1.8 不依赖序列同源性的蛋白质重组 |
| 2 定向进化文库的筛选方法 |
| 2.1 平板筛选 |
| 2.2 表面展示 |
| 2.3 荧光筛选 |
| 3 定向进化技术的应用与展望 |
（6）纤维素酶基因优化及在植物乳酸杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 纤维素资源概述 |
| 1.1 纤维素资源现状 |
| 1.2 纤维素的理化特性 |
| 2 纤维素酶研究进展 |
| 2.1 纤维素酶的微生物来源 |
| 2.2 纤维素酶的理化性质 |
| 2.3 纤维素酶的作用机理 |
| 2.4 纤维素酶的克隆及外源表达 |
| 3 DNA改组研究进展 |
| 3.1 DNA改组的基本原理 |
| 3.2 DNA改组技术的特点 |
| 3.2.1 DNA改组技术可在短时间内实现蛋白质分子的定向进化 |
| 3.2.2 DNA改组技术提高了分子进化的成功率 |
| 3.2.3 DNA改组对筛选技术的要求较高 |
| 4 乳酸杆菌表达系统 |
| 5 本试验目的和意义 |
| 第二章 康氏木霉及黑曲霉中CBHⅠ基因的克隆及鉴定 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 方法和步骤 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 康氏木霉及黑曲霉中总RNA的提取 |
| 1.5.3 纤维素酶基因的RT-PCR |
| 1.5.3.1 纤维素酶基因的c DNA文库建立 |
| 1.5.3.2 纤维素酶基因的PCR扩增 |
| 1.5.4 RT-PCR产物的纯化与回收 |
| 1.5.5 纤维素酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 1.5.6 连接产物的转化 |
| 1.5.7 阳性克隆子的筛选与鉴定 |
| 1.5.7.1 蓝白斑筛选 |
| 1.5.7.2 重组质粒提取 |
| 1.5.7.3 重组质粒的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 康氏木霉及黑曲霉中总RNA的提取 |
| 2.2 纤维素酶基因RT-PCR的扩增结果 |
| 2.3 重组质粒的蓝白斑筛选 |
| 2.4 纤维素酶基因重组克隆的鉴定 |
| 2.5 纤维素酶基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 纤维素酶CBHⅠ基因的DNA改组 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 试验方法和步骤 |
| 1.5.1 基因准备 |
| 1.5.2 纤维素酶基因的片段化 |
| 1.5.2.1 DnaseⅠ内切酶反应条件的确定 |
| 1.5.2.2 基因片段化 |
| 1.5.3 无引物PCR |
| 1.5.4 有引物PCR |
| 1.5.5 改组纤维素酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 1.5.6 连接产物的转化 |
| 1.5.7 重组质粒提取和序列测定 |
| 1.5.8 改组纤维素酶基因序列对比和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 康氏木霉和黑曲霉纤维素酶基因准备 |
| 2.2 纤维素酶基因片段化 |
| 2.3 纤维素酶基因片段化的无引物PCR |
| 2.4 纤维素酶基因片段化的有引物PCR |
| 2.5 改组纤维素酶基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 纤维素酶CBHⅠ改组基因真核表达载体的构建 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 表达质粒pMG36e的图谱 |
| 1.5 培养基和溶液 |
| 1.6 方法和步骤 |
| 1.6.1 改组纤维素酶基因及真核表达载体p MG36e质粒的纯化和回收 |
| 1.6.2 改组纤维素酶基因与真核表达载体pMG36e质粒的连接 |
| 1.6.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α及重组转化子的筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组克隆的构建结果 |
| 2.2 重组表达载体pMG36e-CBHⅠ的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 纤维素酶CBHⅠ改组基因在植物乳酸杆菌中的表达 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 方法和步骤 |
| 1.5.1 乳酸菌感受态的制备 |
| 1.5.2 pMG36e-CBHⅠ电转化植物乳杆菌 |
| 1.5.3 利用菌液PCR检测转化的乳酸菌 |
| 1.5.4 SDS-PAGE检测目的蛋白 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 红霉素抗性筛选结果 |
| 2.2 菌落PCR检测结果 |
| 2.3 蛋白电泳检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 重组植物乳酸杆菌产酶能力及酶活性质研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 培养基和溶液 |
| 1.3 方法和步骤 |
| 1.3.1 重组植物乳杆菌纤维素酶活性的测定 |
| 1.3.1.1 粗酶液的制备 |
| 1.3.1.2 纤维素酶活力测定 |
| 1.3.2 重组植物乳杆菌产纤维素酶酶学性质分析 |
| 1.3.2.1 纤维素酶最适反应温度的测定 |
| 1.3.2.2 纤维素酶最适反应pH的测定 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组植物乳杆菌纤维素酶活性测定结果 |
| 2.1.1 滤纸酶测定结果 |
| 2.1.2 pH变化曲线 |
| 2.2 改组纤维素酶酶学性质分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（7）蛋白酶基因改组和表达及其在羽毛粉酶解和肉鸡生产中的应用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 羽毛粉概述 |
| 1.1 羽毛粉资源现状 |
| 1.2 羽毛粉的理化特性及营养价值 |
| 1.3 羽毛粉的加工处理方法 |
| 2 角蛋白酶研究进展 |
| 2.1角蛋白酶的微生物来源 |
| 2.2 角蛋白酶的理化性质 |
| 2.3 角蛋白酶作用机理 |
| 2.4 角蛋白酶基因的克隆及异源表达 |
| 3 DNA改组研究进展 |
| 3.1 DNA改组的基本原理 |
| 3.2 DNA改组技术的发展 |
| 3.3 DNA改组基因文库筛选 |
| 4 毕赤酵母表达系统 |
| 5 目的和意义 |
| 第二章 羽毛粉降解菌的筛选及降解效果研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 菌种初筛 |
| 2.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌在羽毛粉培养基中产蛋白酶活力测定 |
| 2.3 米曲霉对羽毛粉的降解效果 |
| 2.4 枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果 |
| 2.5 蛋白酶活力测定 |
| 2.6 可溶性蛋白含量测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌种初筛 |
| 3.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌在羽毛粉培养基中产蛋白酶活力 |
| 3.3 米曲霉对羽毛粉降解效果的研究 |
| 3.4 枯草芽孢杆菌对羽毛粉降解效果的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 羽毛粉降解菌的初步筛选和产蛋白酶种类 |
| 4.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌对羽毛粉的降解效果 |
| 5 小结 |
| 第三章 米曲霉和枯草芽孢杆菌蛋白酶基因的克隆与鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 米曲霉和枯草芽孢杆菌总RNA的提取 |
| 2.3 四种蛋白酶基因的RT-PCR |
| 2.4 RT-PCR产物的纯化与回收 |
| 2.5 四种蛋白酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 阳性克隆子的筛选与鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 米曲霉和枯草芽孢杆菌总RNA的提取 |
| 3.2 四种蛋白酶基因RT-PCR的扩增结果 |
| 3.3 四种蛋白酶基因重组质粒的蓝白斑筛选 |
| 3.4 蛋白酶基因重组克隆的鉴定 |
| 3.5 四种蛋白酶基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 米曲霉和枯草芽孢杆菌蛋白酶基因的DNA改组 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 基因准备 |
| 2.2 蛋白酶基因的片段化 |
| 2.3 无引物PCR |
| 2.4 有引物PCR |
| 2.5 改组蛋白酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 蛋白酶基因DNA改组结果筛选 |
| 2.8 重组质粒提取和序列测定 |
| 2.9 改组蛋白酶基因序列比对和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 米曲霉和枯草芽孢杆菌蛋白酶基因准备 |
| 3.2 蛋白酶基因片段化 |
| 3.3 蛋白酶基因片段的无引物PCR |
| 3.4 蛋白酶基因片段的有引物PCR |
| 3.5 改组蛋白酶基因筛选 |
| 3.6 改组蛋白酶基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 蛋白酶基因真核表达载体构建和毕赤酵母转化 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 表达质粒pGAPZαA的图谱 |
| 1.5 培养基和溶液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 蛋白酶基因真核表达载体的构建 |
| 2.2 六种重组pGAPZαA-蛋白酶基因载体的电击转化及在酵母中的高效表达 |
| 2.3 蛋白酶重组酵母菌的鉴定及酶活测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋白酶基因重组质粒载体的构建 |
| 3.2 蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 米曲霉中性蛋白酶基因的二次DNA改组 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 六种蛋白酶基因的准备 |
| 2.2 米曲霉中性蛋白酶基因的二次改组 |
| 2.3 二次改组蛋白酶基因的转化和筛选 |
| 2.4 二次DNA改组蛋白酶基因转化毕赤酵母及酶活测定 |
| 2.5 重组毕赤酵母产蛋白酶酶学性质分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 米曲霉中性蛋白酶基因的二次DNA改组 |
| 3.2 二次改组蛋白酶基因筛选和序列分析 |
| 3.3 重组毕赤酵母酶活分析 |
| 3.4 改组蛋白酶酶学性质分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 发酵羽毛粉营养指标测定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 羽毛粉培养基 |
| 1.2 发酵羽毛粉（fermented feather meal，简称FFM）制备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 指标测定 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 发酵羽毛粉营养物质表观代谢率 |
| 2.2 发酵羽毛粉玉米混合物氨基酸含量分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第八章 不同发酵处理羽毛粉对肉鸡生产性能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验菌株及试剂 |
| 1.2 发酵羽毛粉(FFM)制备 |
| 1.3 试验设计与分组 |
| 1.4 试验日粮 |
| 1.5 饲养管理 |
| 1.6 测定指标及方法 |
| 1.7 数据统计和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡生产性能的影响 |
| 2.2 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡营养物质代谢率的影响 |
| 2.3 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡屠宰性能的影响 |
| 2.4 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡肌肉品质的影响 |
| 2.5 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡肠道微生物数量和消化性酶活力的影响 |
| 2.6 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡肠道微生物区系的影响 |
| 2.7 日粮中添加发酵羽毛粉对黄羽肉鸡血清指标的影响 |
| 2.8 日粮中添加发酵羽毛粉代替鱼粉经济效益分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡生长性能的影响 |
| 3.2 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡营养物质代谢的影响 |
| 3.3 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡屠宰性能和肉品质的影响 |
| 3.4 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡肠道消化酶活力的影响 |
| 3.5 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡肠道微生物的影响 |
| 3.6 发酵羽毛粉对黄羽肉鸡血液生化指标的影响 |
| 3.7 日粮中添加发酵羽毛粉替代鱼粉经济效益分析 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（8）定向进化技术在蛋白质开发中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 定向进化技术 |
| 1.1 易错PCR技术 |
| 1.2 DNA改组 |
| 2 定向进化技术在蛋白质开发中的应用 |
| 2.1 提高蛋白产量 |
| 2.1.1 目的蛋白过表达 |
| 2.1.2 蛋白质生物合成途径的调控 |
| 2.2 蛋白质性质的改良 |
| 2.3 修饰蛋白, 赋予新的功能 |
| 3 小结 |
（9）南极假丝酵母脂肪酶B的分子改造及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 南极假丝酵母脂肪酶B概述 |
| 1.1.1 脂肪酶的定义与来源 |
| 1.1.2 南极假丝酵母脂肪酶B的简介 |
| 1.1.3 南极假丝酵母脂肪酶B的催化反应机制 |
| 1.1.4 南极假丝酵母脂肪酶B的表达系统 |
| 1.2 南极假丝酵母脂肪酶B的应用 |
| 1.2.1 CALB在手性药物拆分中的应用 |
| 1.2.2 CALB在酯类物质合成中的应用 |
| 1.3 酶的分子改造研究 |
| 1.3.1 理性设计 |
| 1.3.1.1 定点突变 |
| 1.3.1.2 蛋白质融合 |
| 1.3.2 非理性设计 |
| 1.3.2.1 易错PCR |
| 1.3.2.2 DNA改组 |
| 1.4 结语与展望 |
| 1.5 本论文的研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 南极假丝酵母脂肪酶B的分子改造 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.2.1.2 培养基 |
| 2.2.1.3 工具酶 |
| 2.2.1.4 试剂 |
| 2.2.1.5 仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 蛋白质电泳和核酸电泳 |
| 2.2.2.1 E.coli JM109/pPICZa A-CALB重组质粒的提取 |
| 2.2.2.2 突变质粒库的建立 |
| 2.2.2.3 酶切除去模板 |
| 2.2.2.4 E.coli JM109感受态的制备及转化 |
| 2.2.2.5 突变体CALB质粒的线性化 |
| 2.2.2.6 酵母感受态细胞的制备及电转化 |
| 2.2.2.7 突变体CALB的诱导表达 |
| 2.2.2.8 优良突变体的筛选 |
| 2.2.2.9 正向突变CALB序列测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.2 第一轮定点突变 |
| 2.3.3 第二轮定点突变 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 突变体D-4的分离纯化及酶学性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 菌株 |
| 3.2.1.2 培养基及溶液配制 |
| 3.2.1.3 试剂 |
| 3.2.1.4 主要实验仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 突变体D-4活力的测定 |
| 3.2.2.2 蛋白质浓度的测定 |
| 3.2.2.3 D-4的分离纯化 |
| 3.2.2.4 透析 |
| 3.2.2.5 最适pH的测定 |
| 3.2.2.6 pH稳定性研究 |
| 3.2.2.7 最适温度的测定 |
| 3.2.2.8 热稳定性研究 |
| 3.2.2.9 金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶酶活的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.0 突变CALB的分离纯化 |
| 3.3.1 突变脂肪酶D-4最适pH的测定 |
| 3.3.2 突变脂肪酶的pH稳定性 |
| 3.3.3 突变脂肪酶最适温度的测定 |
| 3.3.4 突变脂肪酶的热稳定性 |
| 3.3.5 金属离子和表面活性剂对重组脂肪酶酶活的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 南极假丝酵母脂肪酶B的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 菌种 |
| 4.2.1.2 培养基 |
| 4.2.1.3 主要试剂 |
| 4.2.1.4 主要仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 突变前后CALB水解活力比较 |
| 4.2.2.2 突变前后CALB酯化活力比较 |
| 4.2.2.3 突变前后CALB立体选择性的比较 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 突变前后CALB水解活力比较 |
| 4.3.2 突变前后CALB酯化活力比较 |
| 4.3.3 突变前后CALB选择性的比较 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
四、DNA改组及其应用（论文参考文献）
- [1]基于定向进化和理性化设计的AAV载体改造[D]. 韩增鹏. 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所), 2020(02)
- [2]一种高效的多点组合突变方法的构建与应用[D]. 王杰. 天津科技大学, 2019(08)
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- [9]南极假丝酵母脂肪酶B的分子改造及其应用[D]. 任春梅. 浙江工业大学, 2014(05)
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