一、SARS-CoVS2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达（论文文献综述）
王一[1]（2021）在《猪整合素αvβ1在PEDV感染过程中作用的初步研究》文中认为猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,对新生仔猪危害极大,给世界养猪业造成巨大的经济损失。PEDV入侵宿主细胞的机制尚不明确,受体研究至今存在争议。整合素可以作为多种病毒的感染受体或感染相关蛋白。实验室前期研究表明猪整合素αvβ3与PEDV感染有关,与整合素αvβ3同家族的整合素αvβ1是否与PEDV感染具有相关性呢?本试验对猪整合素αvβ1与PEDV的感染作用进行了研究,为PEDV感染机制的理解和抗病毒药物的研发提供新的理论基础。为验证猪整合素αvβ1在PEDV感染过程中的作用,本研究制备猪整合素β1多克隆抗体。通过截取抗原性良好的猪整合素β1胞外区基因进行人工合成,将其克隆至p GEX-6p-1原核表达载体,对猪整合素β1基因进行表达;对成功表达的重组蛋白利用切胶方法进行纯化,以纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备猪整合素β1多克隆抗体。结果显示,成功构建了猪整合素β1原核表达载体,并在BL21中成功表达,主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量大小约为102 k Da。纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,间接ELISA鉴定抗体效价达到1:12 800。经Western blot检测,制备的猪整合素β1多克隆抗体能够特异的识别仔猪小肠组织中的整合素β1蛋白。为验证猪整合素αvβ1在PEDV感染Vero E6细胞的作用,本研究构建了猪整合素β1的真核表达载体,利用脂质体转染的方法成功在Vero E6细胞内表达。利用过表达、si RNA沉默技术处理Vero E6细胞后接种PEDV,通过q PCR和Western blot分别检测PEDV的m RNA水平和蛋白水平变化。猪整合素αvβ1过表达结果显示,与对照组相比,接毒24 h后,试验组PEDV ORF3基因m RNA水平及PEDV N蛋白水平均极显着升高（p<0.01）;接毒48 h后,试验组PEDV ORF3基因m RNA水平及PEDV N蛋白水平也均显着升高（p<0.05）。整合素αvβ1沉默结果显示,与对照组相比,试验组PEDV ORF3基因m RNA水平及PEDV N蛋白水平极显着降低（p<0.001）。上述结果表明,猪整合素αvβ1促进PEDV感染Vero E6细胞。为验证猪整合素αvβ1在PEDV感染Vero E6细胞过程中黏附和内化阶段的作用,在Vero E6细胞中过表达及沉默猪整合素αvβ1后,接种PEDV,通过q PCR检测PEDV的m RNA水平。过表达猪整合素αvβ1结果显示,与对照组相比,在感染的黏附和内化阶段,试验组PEDV ORF3基因m RNA水平显着升高（p<0.05）。沉默整合素αvβ1结果显示,与对照组相比,在感染的黏附和内化阶段,试验组PEDV ORF3基因m RNA水平极显着降低（p<0.01）。上述结果表明,猪整合素αvβ1在PEDV感染Vero E6细胞的黏附和内化阶段具有促进作用。综上所述,本试验成功获得猪整合素β1多克隆抗体;明确猪整合素αvβ1促进PEDV感染Vero E6细胞,且在PEDV黏附和内化阶段发挥作用。为后续PEDV感染机制研究提供物质基础,拓宽了PEDV感染机制的理解。
韩郁茹[2]（2021）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中认为猪急性腹泻综合征（SADS）是由猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）引起的一种新型猪消化道传染性疾病,于2017年初首次暴发。猪群感染后表现出典型的肠道传染病症状,是猪病防控和养猪业发展须面临的巨大难题。因此研发SADS-CoV感染的诊断试剂及疫苗防控显得尤为重要。冠状病毒核衣壳蛋白具有多种重要的生物学意义,一方面可与病毒RNA结合参与多种病毒生物学活性,另一方面其自身较高的免疫原性可使机体在感染病毒后不久就可产生大量抗体。因此冠状病毒N蛋白可作为猪场大规模疫情早期检测和诊断的理想靶抗原。本研究制备了针对SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体,并鉴定了其在不同实验室检测方法中的应用情况。首先,本研究构建了原核表达系统,以此来表达、纯化SADS-CoV N蛋白,并测定蛋白浓度。Western Blot和SDS-PAGE检测结果表明本研究获得高纯度且免疫原性良好的SADS-CoV N蛋白。其次,本研究利用已纯化好的SADS-CoV N蛋白来制备N蛋白的鼠源单克隆抗体。采用间接ELISA检测方法和有限稀释法,本研究最终获得能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞共5株,分别为杂交瘤细胞1A5,3E9,4C6,4H6和5D7。随后,制备腹水抗体。抗体亚类检测试剂盒鉴定结果表明这5株单克隆抗体（MAbs）的轻链均为κ链,MAbs 3E9、4C6和5D7的重链为Ig G1,MAb 4H6的重链为Ig G2a,MAb 1A5的重链为Ig G2b。间接ELISA方法检测其抗体效价,发现5株MAbs在较高稀释梯度时仍可与SADS-CoV N蛋白反应,说明抗体效价较高,具有良好的反应原性。经Western Blot检测,5株MAbs与其它猪冠状病毒均不发生反应,只与SADS-CoV发生特异性反应,且反应原性良好。接着,本研究对已制备的5株MAbs进行功能应用的验证。结果发现这5株MAbs（1A5,3E9,4C6,4H6和5D7）通过间接免疫荧光均可检测出感染Vero E6细胞的SADS-CoV。其中对MAb 3E9进行了进一步试验验证,发现该单抗可用于免疫组织化学试验来检测SADS-CoV。利用MAb 3E9还可通过免疫共沉淀试验与Vero E6细胞中的SADS-CoV反应。最后,本研究对MAbs 3E9和4C6所识别的SADS-CoV N蛋白抗原表位进行了鉴定。即利用生物信息学软件和真核表达系统,Western Blot鉴定结果表明,MAbs 3E9和4C6识别同一线性表位,即343DAPVFTPAP351。随后分析比对该区域的氨基酸序列,可看到该抗原表位序列在SADS-CoV分离株和其它SADS相关冠状病毒中高度保守,也进一步说明了MAbs 3E9和4C6识别的N蛋白抗原表位具有高度特异性。综上所述,本研究共筛选出5株针对SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞并制备腹水;鉴定了这5株MAbs的亚型,检测了其免疫原性及特异性等特征;分析了它们在ELISA、IFA、IHC、Co-IP等方面的应用情况。另外,本研究鉴定了MAbs 3E9和4C6识别的N蛋白抗原表位。
苏明俊[3]（2021）在《PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制》文中认为猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,给我国养猪业带来严重危害。尽管PEDV疫苗在我国广泛应用,PED仍然频繁发生。因此,PEDV防控相关的基础研究十分必要。病毒与宿主长期相互作用过程中,能通过介导宿主细胞周期阻滞创造有利于病毒复制的细胞微环境。由此可见,阐明病毒调控细胞周期阻滞的机制,能为抗病毒设计提供理论基础。目前,PEDV等冠状病毒的N蛋白能诱导细胞周期阻滞,但其机制尚未明晰。本研究对PEDV N蛋白介导细胞周期阻滞的机制进行了研究,进一步探索了基于该机制的抗病毒药物。研究内容包括以下四个方面:1.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响为明确PEDV N蛋白对细胞周期的调控作用,将N蛋白在非同步化Vero E6细胞和血清饥饿法介导的G0/G1期、胸苷介导的S期、诺考达唑介导的G2/M期同步化的Vero E6细胞中分别过表达,对细胞周期和病毒滴度进行检测与分析。结果显示,在非同步化细胞中,不同浓度N蛋白组的S期细胞占比分别为22.91%（1.0μg/m L）、29.66%（2.5μg/m L）和36.38%（4.5μg/m L）,均显着高于对照组（21.68%）,N蛋白浓度与S期细胞数量正相关;在N蛋白（4.5μg/m L）过表达的G0/G1期、S期、G2/M期同步化细胞中,S期细胞占比分别为32.07%、58.50%和25.50%,均显着高于对照组（14.08%、49.56%和8.30%）（P<0.01）。在非同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.45 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.67 log10 TCID50/m L)（P<0.01）;在同步化细胞中,PEDV滴度（48 hpi）为5.54 log10 TCID50/m L,显着高于对照组(4.77 log10 TCID50/m L)（P<0.01）。上述结果证明,PEDV N蛋白能介导Vero E6细胞发生S期阻滞,S期阻滞增强PEDV复制。2.PEDV N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞分子机制研究为揭示PEDV N蛋白诱导细胞S期阻滞的机制,本研究利用活细胞成像系统、免疫共沉淀（Co-IP）和N蛋白截短突变体构建等方法,探索了p53-DREAM信号通路在PEDV N蛋白介导细胞S期阻滞中潜在的作用。结果显示,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中p53表达水平显着升高（P<0.01）;利用p53抑制剂PFT-α处理细胞后,在N蛋白过表达的Vero E6细胞中S期细胞占比和PEDV滴度均显着下降（P<0.05）。PEDV N蛋白能显着上调p21表达、抑制p130磷酸化、下调E2F4和cyclin A表达（P<0.01）;同时,PFT-α能拮抗N蛋白对p21、p130、E2F4和cyclin A的调控作用（P<0.05）。这些数据证明,PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路介导Vero E6细胞发生S期阻滞。进一步研究显示,N蛋白与p53在Vero E6细胞核中存在共定位,维持p53在细胞核中高水平表达;N蛋白介导细胞S期阻滞依赖于N蛋白与p53核共定位以及N蛋白的核定位信号S71NWHFYYLGTGPHADLRYRT90。进一步证实,N蛋白与p53存在直接相互作用,关键氨基酸区域是S171RGNSQNRGNNQGRGASQNRGGNN194(NS171-N194),其中,G183RG185为核心氨基酸位点。N蛋白突变体Nmut(R183RR185)与p53相互作用显着减弱,介导细胞周期S期阻滞显着下降（32.79%）（P<0.01）;在Nmut过表达的Vero E6细胞中,PEDV滴度(5.38 log10 TCID50/m L)显着低于对照组(5.67 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果证明,PEDV N蛋白入核后通过NS171-N194区域与p53直接相互作用,维持p53高水平表达,进而激活p53-DREAM信号通路,介导Vero E6细胞发生S期阻滞。3.基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计为获得能干预PEDV N蛋白介导细胞周期S期阻滞的小分子药物,本研究利用分子对接技术筛选能靶向结合N蛋白S171-N194区域的小分子化合物,进一步评价筛选的小分子化合物抗病毒作用。分子对接分析显示,金丝桃苷（Hyperoside）与PEDV N蛋白具有较强的结合力,“-CDOCKER ENERGY”和“-CDOCKER INTERACTION ENERGY”值分别为24.47和49.57。生物膜干涉技术（BLI）分析显示,金丝桃苷与N蛋白具有特异性结合作用,呈现浓度依赖性。金丝桃苷能拮抗N蛋白与p53相互作用（P<0.05）,干预N蛋白介导Vero E6细胞S期阻滞（P<0.05）。金丝桃苷处理组中PEDV滴度为5.13 log10TCID50/m L,显着低于对照组(5.63 log10 TCID50/m L)（P<0.05）。上述结果表明,基于N蛋白调控细胞周期机制设计的小分子药物金丝桃苷,能够拮抗PEDV N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。4.PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2上验证由于Vero E6细胞是PEDV非本宿主的易感细胞,本研究进一步在猪肠道细胞IPEC-J2中对PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制进行了验证。结果显示,在过表达N蛋白的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（40.94%）显着高于对照组（37.57%）（P<0.01）,PEDV复制显着增强（P<0.05）。进一步研究证实,PEDV N蛋白与猪源p53存在直接相互作用;在表达Nmut的IPEC-J2细胞中,S期细胞占比（37.57%）显着低于对照组（40.94%）（P<0.05）;金丝桃苷显着降低IPEC-J2 S期细胞占比（P<0.05）,抑制PEDV复制（P<0.05）。上述结果表明,PEDV N蛋白介导IPEC-J2细胞周期S期阻滞的分子机制与Vero E6细胞一致。综上所述,PEDV N蛋白进入细胞核后,通过自身NS171-N194区域与p53相互作用,激活p53-DREAM信号通路,从而诱导宿主细胞S期阻滞,为PEDV复制创造了有利的细胞微环境。基于PEDV N蛋白介导的细胞周期阻滞机制设计的小分子药物金丝桃苷,能通过靶向拮抗N蛋白与p53相互作用,干预N蛋白介导细胞周期S期阻滞,进而抑制PEDV复制。本研究揭示了PEDV N蛋白调控宿主细胞周期的一个新机制,为PEDV等冠状病毒的抗病毒策略提供了新思路。
张记宇[4]（2021）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制》文中认为猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-Co V）是2017年首次在中国发现的猪肠道冠状病毒,主要引起5日龄以下的新生仔猪水样腹泻、呕吐、脱水、最终死亡。SADS-Co V的暴发引起了研究人员的高度重视,然而SADS-Co V感染是否诱导宿主细胞凋亡以及诱导的细胞凋亡对SADS-Co V复制的影响尚不清楚。因此本研究的目的与意义就是探究SADS-Co V感染诱导宿主细胞凋亡的现象以及细胞凋亡对SADS-Co V复制的影响,解析SADS-Co V感染引起细胞凋亡的发生途径,详细阐明SADS-Co V感染与细胞凋亡之间的相互作用机制,为SADS-Co V的防控提供科学依据与理论基础。为了揭示SADS-Co V在体内和体外是否能诱导细胞凋亡。通过透射电镜观察感染SADS-Co V的Vero E6细胞,结果发现细胞明显皱缩,线粒体肿胀,细胞核萎缩,染色质凝聚。TUNEL方法检测发现SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞后诱导明显的细胞凋亡。DNA Ladder分析结果显示,SADS-Co V感染可使细胞基因组的DNA发生断裂出现明显的片段化,且DNA片段化程度随着接毒时间的延长和接毒剂量的增加而增加。为了进一步得到准确的细胞凋亡比率,本研究采用流式细胞术检测细胞,结果显示细胞凋亡比率随着SADS-Co V感染时间的延长而增高,SADS-Co V感染后48 h凋亡率分别为25.7%（Vero E6）和37.5%（IPI-2I）,表明SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞后诱导明显的细胞凋亡。Caspase是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,是细胞凋亡发生过程中的关键酶。Western blot结果显示SADS-Co V感染Vero E6和IPI-2I细胞能激活Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3,活化的Caspase-3剪切下游PARP（poly ADP-ribose polymerase）,使PARP失活而诱导凋亡。同时SADS-Co V感染的仔猪回肠组织中Caspase-3和PARP均被切割,表明SADS-Co V在体内诱导仔猪回肠上皮细胞凋亡。为了进一步确定SADS-Co V诱导细胞凋亡的途径,Western blot结果显示SADS-Co V感染Vero E6细胞后,Fas L上调表达,表明SADS-Co V能激活Fas L介导的外源性途径。此外,SADSCo V感染可导致Bid被切割成15 k Da t Bid,表明Fas L介导的凋亡信号激活Caspase-8,进而切割Bid。切割的Bid促进Caspase-9的激活,将内源性和外源性途径相互联系。本研究也通过Western blot、流式细胞术、免疫荧光等试验方法检测使用不同的凋亡抑制剂后细胞的凋亡情况和病毒的复制情况。结果显示,使用广谱凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK（Caspases-8的抑制剂）和Z-LEHD-FMK（Caspases-9的抑制剂）均能抑制PARP的裂解和SADS-Co V N蛋白的表达,且病毒滴度也呈剂量依赖性降低。激光共聚焦试验和Western blot检测结果显示SADS-Co V感染后促凋亡蛋白Bax和细胞色素c（Cyt c）分别重新定位于线粒体和细胞质,表明SADS-Co V通过线粒体介导的内源性途径诱导凋亡。亲环素D（Cyp D）位于线粒体膜基质中,是线粒体通透性转换孔（MPTP）开放过程中的主要成分。使用Cyp D的特异性抑制剂环孢素A（Cs A）孵育Vero E6和IPI-2I细胞可抑制SADS-Co V诱导的凋亡和病毒复制,表明Cyp D参与了这个过程。综合以上研究表明,Fas/Fas L介导的死亡受体途径和线粒体介导的内源性凋亡途径在SADSCo V感染的细胞中都被激活,揭示了SADS-Co V诱导细胞凋亡的分子机制,提高了我们对SADSCo V发病机制的认识。
于海男[5]（2021）在《携带sgRNA/ASFV p30-CRISPR/Cas9的rPRV的构建及初步鉴定》文中研究说明非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是一种急性、热性、出血性猪的传染病,强毒株可致家猪和野猪死亡率达100%,2018年8月首次传入中国后使我国养猪业遭受重创。目前针对非洲猪瘟没有有效药物,且已研制的有关非洲猪瘟的亚单位疫苗、灭活疫苗、弱毒疫苗等均不能对免疫个体提供完全保护,因此十分迫切需要开发针对本病的预防与治疗新方法。本实验构建了针对非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）复制必须基因p30的CRISPR/Cas9基因编辑系统,靶向切割p30基因,为有效抑制ASFV的病毒复制提供可能。本实验针对构建靶向ASFV p30基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建及初步鉴定做了如下内容研究:1.克隆ASFV p30基因,构建mCherry红色荧光报告基因与p30融合表达的真核表达质粒p30-mCherry。通过网站设计5条针对p30基因的sgRNAs,构建靶向p30基因的CRISPR-Cas9基因编辑质粒PX458-1、PX458-2、PX458-3、PX458-4、PX458-5。通过将靶向p30基因的PX458质粒与p30-mCherry质粒共转染HEK 293T细胞,根据荧光观察、荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）及Western Blot方法检测p30表达情况,鉴定切割效率,结果显示PX458-3、PX458-4可以有效切割p30基因,显着降低p30的表达,因此选定PX458-3、PX458-4作为两个有效靶点,用于后续实验。2.选择PX458-3质粒,将其CRISPR/Cas9基因编辑系统序列插入PRV转移质粒pc DNA3.1-LR,构建表达靶向p30基因的PRV真核转移质粒3.1LR-Cas9,与PRV Bartha K61株病毒进行同源重组,构建靶向ASFV p30基因并表达Cas9蛋白的重组病毒K61-Cas9。将K61-Cas9重组病毒先感染Vero E6细胞,4小时后再转染p30-mCherry质粒,48小时后根据荧光观察、qPCR及Western Blot方法检测p30表达情况,结果显示p30荧光表达明显致弱,荧光定量PCR方法检测表达水平显着性降低,表明该CRISPR/Cas9基因编辑系统对p30表达有抑制作用,从而为研制抗非洲猪瘟病毒生长制剂和疫情防控提供了新的研究思路。
刘建波[6]（2020）在《猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究》文中提出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）主要引起幼龄仔猪腹泻、呕吐、脱水和死亡,死亡率高达100%,给养猪业带来重大经济损失。尽管目前已经有防控PEDV的疫苗,但是由于预防接种的盲目性,导致免疫失败的现象在很多猪场出现,仍有猪场发生PEDV引起的仔猪腹泻并导致经济损失。为克服接种疫苗的盲目性,有必要建立评价母源抗体水平的诊断方法。此外,建立快速诊断PEDV的试纸条可以第一时间内确诊仔猪腹泻是否由PEDV引起,以便对猪群进行紧急接种以达到控制PEDV流行的效果。在确诊PEDV感染的情况下,猪群由紧急接种到产生抗体至少需要7天时间,有必要研制治疗PEDV的抗体类药物,对已发病猪群进行治疗来降低经济损失。分泌性IgA（Secretory IgA,SIgA）抗体为黏膜免疫系统中重要的效应分子,为检测PEDV特异性SIgA抗体,本研究以纯化的PEDV粒子为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子为检测样品,以辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪SIgA分泌成分（Secretory component,SC）的抗体为酶标二抗,建立了检测初乳和肠道黏膜中的PEDV SIgA间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、重复性和敏感性实验。该方法与TGEV、PoRV阳性初乳无交叉反应,经间接免疫荧光（IFA）标定,当初乳中抗体效价在1:200到1:6400之间时,该ELISA的敏感性较好;批内和批间实验表明重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIgA水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,为选择合适的预防接种时间提供了技术支持。为快速确诊仔猪腹泻是由PEDV引起的,以纯化的抗PEDVN蛋白的15B12单抗和兔IgG抗体用含有铕（Eu）元素的荧光纳米微球进行标记,将其用喷金仪喷于结合垫上;以抗PEDVN蛋白的4H7单抗作为捕获抗体用喷膜机喷涂在硝酸纤维膜（NC）上形成检测线T;将羊抗兔IgG抗体用喷膜机喷涂在NC形成质控线C线,组成检测PEDV的荧光快速检测试纸条。用荧光检测仪分别采集T线处荧光峰值（HT）和C线的荧光峰值（HC）,并计算HT/HC的比值,根据比值确定检测结果。当检测值大于0.05时,表明该样品含有PEDVN蛋白或PEDV。用该试纸条检测TGEV、PoRV等其它病毒时均呈阴性反应,敏感性试验结果表明,该PEDV荧光检测试纸条的灵敏度要高于RT-PCR的灵敏度。研制的试纸条为快速确诊PEDV提供了技术手段。为筛选具备中和PEDV的单克隆抗体,以纯化的PEDV流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原,免疫BALB/c小鼠,经融合后筛选获得1株稳定分泌抗PEDV的杂交瘤细胞株,命名为1B9。病毒中和实验表明,该单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株,使其失去感染细胞的能力,但不能中和CV777毒株（G1基因亚型）。为阐明1B9单抗中和病毒的分子机制,本研究用抗PEDV多克隆抗体（pAb）和1B9单抗筛选PEDV LNCT2的突变毒株。经过连续30代次中和试验,成功筛选到1B9单抗的逃逸毒株,命名为Mutant-1B9,但该逃逸毒株仍然被PEDV的pAb中和。序列分析发现,在突变毒株的s基因中缺失了两个区域:55IGENQ59和609F,使得Mutant-1B9能够逃避1B9单抗的中和作用。上述结果表明,缺失的氨基酸参与了构象表位的形成,为构象表位的定位提供了有价值的信息。推测中和抗体通过结合上述位置影响病毒与受体的结合而发挥中和作用。此外,没有筛选出PEDV多抗的逃逸毒株。这表明pAbs或基于多个单克隆抗体的联合疗法在控制PEDV感染方面的具有潜在效用。综上所述,本研究建立了检测PEDV特异性SIgA的ELISA方法;建立了检测PEDV抗原的荧光快速检测试纸条;筛选到一株具备中和PEDV的中和性单克隆抗体,该抗体识别的表位为构象表位,其中55IGENQ59和609F位为抗体结合的关键氨基酸位点,中和抗体通过结合这些位置后影响病毒与受体的结合而发挥中和作用。上述研究结果为防控PEDV提供了重要的技术手段和理论支持,具有广阔的应用前景及研究意义。
张凡庆[7]（2020）在《猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究》文中研究表明仔猪腹泻占新生仔猪总死亡率的50%以上,是对养猪业造成经济损失的重要疾病之一。目前临床常见的仔猪腹泻病原包括猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）。发病仔猪表现为腹泻、脱水、生长迟缓和最终死亡。PEDV和TGEV的预防措施是将疫苗免疫母猪,初生仔猪吸吮乳汁被动获得抗体。然而疫苗不能使所有母猪产生高水平乳源抗体,每头仔猪吮乳时间长短不同,很难保证仔猪都获得足够抗体抵抗病毒感染。ETEC的防控依靠抗生素,然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性。鉴于此,寻求有效对抗这些病原感染的新型免疫制剂显得极为重要。对于消化道病原感染,给动物口服特异性抗体或抗体衍生物是有效的防治方式。然而传统的抗体制剂存在均一性差、抗体来源与受治动物种属不同易产生免疫排斥等问题。随着生物技术的发展,基因工程抗体成为新型抗体制剂的研究热点,基因工程抗体中最具代表性的是单链抗体（single-chain fragment variable,scFv）。人类医学领域有关scFv治疗疾病的研究已很成熟,兽医领域的相关研究则刚刚开始,特别是猪源性scFv的研究以及scFv防治猪腹泻病原的感染鲜有报道,而这方面的研究对猪腹泻病原体新型防治策略的研发具有重要意义。基于此,本研究构建了猪源噬菌体-scFv库,筛选了抗猪源腹泻病原体（PEDV、TGEV和ETEC）scFv,并研究了scFv的生物学特性和保护作用。研究内容包括五个方面:1猪源性抗猪腹泻重要病原体scFv的获得为了获得抗猪腹泻重要病原体scFv序列,构建了猪源噬菌体-scFv库,库容量为5.5×107 cfu/m L(VH-Linker-VLκ)和7.2×107 cfu/mL（VH-Linker-VLλ）。从库中随机挑取12个克隆测序,证实构建的库来源于猪抗体序列,具有多样性。分别以PEDV、TGEV全病毒以及提纯的ETEC K88ac菌毛作为抗原,对构建的猪源噬菌体-scFv库进行筛选,获得了3株高亲和力的抗PEDV scFv（PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）、4株抗TGEV scFv（TZZ 14、TZZ 19、TZZ 43和TZZ 46）以及2株抗ETEC K88ac scFv（EZZ 3和EZZ 24）。将scFv序列进行原核表达及纯化,获得了具有活性的可溶性蛋白。这些猪源scFv应用于仔猪时避免了因抗体与受治动物种属不同而造成机体对抗体产生免疫排斥。2 scFv的生物学特性研究2.1抗PEDV和TGEV scFv的生物学特性研究为了研发抗PEDV和TGEV的新型scFv口服制剂,对针对PEDV和TGEV scFv的生物学特性进行研究。稳定性试验发现4℃保存时添加蛋白酶抑制剂延长了scFv的活性。亲和力试验证实这些scFv的亲和力均在107-108 M-1。分析scFv结合的病毒蛋白,发现PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35均与PEDV S蛋白的S1亚基结合,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46与TGEV S蛋白结合,TZZ 43与TGEV N蛋白结合。病毒中和实验证实上述针对S蛋白的scFv具有抗病毒效果,而且将PZZ21、PZZ 24和PZZ 35联合使用的抗病毒效果好于单个scFv,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46也显示出协同作用。分析scFv影响PEDV感染细胞的阶段,发现PZZ21、PZZ 24和PZZ 35在病毒结合细胞时发挥抗病毒作用,而在入侵阶段无作用。2.2抗ETEC K88ac菌毛scFv的生物学特性研究ETEC K88ac菌毛介导细菌对肠上皮的黏附,是引起腹泻的先决条件。细胞黏附抑制实验证实抗ETEC K88ac的scFv EZZ 3和EZZ 24能抑制ETEC黏附IPEC-J2细胞,抑制率达51.9±2.7%和46.7±2.1%,EZZ 3和EZZ 24联合使用对细菌的黏附抑制率达62.6±1.5%。进一步建立了ETEC感染小鼠的腹泻模型,使用该模型分析了EZZ 3和EZZ 24对小鼠的保护作用。结果发现,与ETEC攻毒组相比,scFv处理组小鼠感染ETEC后仅表现轻度腹泻症状,肠道结构完整。此外scFv口服不会造成小鼠组织细胞损伤,不影响小鼠生长,具有安全性。3壳聚糖纳米scFv口服制剂的研制虽然上述研究证明抗PEDV和TGEV scFv在体外中和病毒感染,抗ETEC scFv对ETEC引起的小鼠腹泻具有保护作用,但仔猪消化道环境复杂,抗体口服后可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶影响导致疗效降低。为了提高scFv在仔猪胃肠道稳定性,本研究以羧甲基壳聚糖为原料制备了p H响应性scFv纳米口服制剂（CMCS/CS-scFv）。通过优化投入比例和反应条件,得到的CMCS/CS-scFv粒径为292±21 nm,PDI为0.24±0.12。CMCS/CS-scFv纳米制剂眼观呈光泽的乳白色,透射电镜下呈现球形,大小均一。CMCS/CS-scFv能抵抗胃酸对scFv的破坏,其释放具有p H响应性,酸性环境下少量释放,碱性环境中快速释放。此外CMCS/CS-scFv对肠道细胞和仔猪没有毒性,具有安全性。本研究为开发scFv口服制剂的新剂型提供了科学依据。4纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪病原性腹泻的保护作用研究为了验证CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护功能,首先比较了scFv和CMCS/CS-scFv对仔猪感染单一病原体的保护效果。PEDV的仔猪保护实验发现,CMCS/CS-PZZ（PZZ包括scFv PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）和PZZ灌服后对仔猪感染PEDV具有保护作用,而且CMCS/CS-PZZ处理后仔猪的腹泻指数显着低于口服PZZ（p<0.05）,显示出更好的保护效果。TGEV动物实验也证实CMCS/CS-TZZ（TZZ包括scFv TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46）处理组对仔猪腹泻的保护效果好于TZZ处理组,粪便病毒载量显着低于TZZ处理组（p<0.05）。ETEC动物实验证实CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC提供保护,而且CMCS/CS-EZZ口服后保护效果好于EZZ。针对仔猪腹泻往往是多个病原混合感染,将CMCS/CS-scFv（包括PZZ、TZZ、EZZ）联合应用,发现CMCS/CS-scFv灌胃后粪便中病毒粒子和细菌数量显着低于攻毒组（p<0.05）,存活率高于攻毒组,说明CMCS/CS-scFv联合应用对病原混合感染具有保护效果,为临床大规模应用和制剂优化奠定了基础。5分泌表达scFv的乳酸乳球菌对仔猪病原性腹泻的保护作用研究scFv治疗仔猪腹泻时,其在肠道存留时间越长效果越好,为了使scFv在肠道持续释放,受乳酸菌活载体疫苗的启发,将抗猪腹泻病原体scFv与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）表达系统结合,构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv（scFv包括PZZ 21、TZZ 19和EZZ 3）。体外实验测定了重组L.lactis-scFv的酸碱耐受性,体内实验证实重组L.lactis-scFv靶向定殖在仔猪肠道黏膜并分泌scFv。细胞保护实验证实了分泌的抗病毒scFv对PEDV、TGEV的中和效果,抗K88ac scFv对ETEC黏附细胞的抑制作用。动物保护实验证实重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原产生保护作用,PEDV、TGEV或ETEC感染引起的腹泻症状减轻。本研究为治疗仔猪腹泻的新型scFv口服投递系统研发提供了科学依据。综上所述,本研究首先构建了猪源噬菌体-scFv库,从中筛选到具有活性的抗PEDV、TGEV和ETEC K88ac scFv;然后通过细胞实验分析了抗PEDV和TGEV scFv结合的病毒蛋白及中和病毒作用,细胞黏附抑制实验和小鼠保护实验证实了抗ETEC K88ac scFv防治腹泻的功能;进一步研制了抵抗胃部酸性环境和蛋白酶的纳米口服制剂CMCS/CS-scFv,增加了scFv口服稳定性;仔猪保护实验证实了scFv和CMCS/CS-scFv对PEDV、TGEV和ETEC引起的仔猪腹泻均具有保护作用,并且口服CMCS/CS-scFv具有比scFv更好的保护效果;将CMCS/CS-scFv联合应用,证实对仔猪腹泻病原混合感染提供保护;构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv,证实了重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原体具有良好的保护作用。本研究为仔猪腹泻病原的防治探索了新的途径,也为其它动物疫病的抗体制剂防治提供了有益借鉴。
王潇博[8]（2020）在《PEDV感染Vero E6细胞mRNA/miRNA表达谱分析及Abl2影响病毒复制机制研究》文中提出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）属于α冠状病毒,可引起仔猪产生急性的、高度接触性肠道传染病。PEDV的感染会导致宿主细胞mRNA与miRNA表达水平动态的变化,并与病毒形成复杂的作用网络。全面的分析差异表达宿主因子对PEDV复制的调控,有助于完整地掌握病毒感染后细胞组分、生物学功能、信号通路的变化规律,了解PEDV的致病机制,筛选影响病毒入侵、调控病毒复制的宿主因子。Vero E6细胞是PEDV分离、传代和进行实验研究的主要细胞。本研究通过对感染PEDV弱毒株CV777与强毒株LNct2的Vero E6细胞进行RNA高通量测序,分析细胞内mRNA及miRNA的差异表达情况。与对照组相比,CV777感染组筛选出33个差异表达基因,LNct2感染组筛选出1854个差异表达基因,两组共有的差异基因为16个。miRNA测序结果显示CV777感染组共产生23个差异表达miRNA,LNct2感染组共产生70个差异表达miRNA,两组共有的差异表达miRNA为10个。对差异表达的宿主因子进行生物信息学分析,结果显示差异表达因子主要富集在调控细胞内信号转导、细胞代谢、细胞凋亡等通路上,干扰素刺激因子APOBEC3、OASL、MX2、IFITM3等均下调表达,提示PEDV通过拮抗IFN抗病毒分子的表达从而逃逸宿主先天性免疫反应。另外,RNA-seq测序结果显示PEDV感染激活MAPK等信号通路。进一步研究发现PEDV感染后上调表达的宿主因子Abl2可以影响病毒的复制。Abl2是一种非受体酪氨酸激酶,调控细胞多种生命进程。通过western blot、测定TCID50试验发现,沉默Abl2后病毒N蛋白的表达、病毒滴度均显着下降。应用Abl2特异性抑制剂imatinb、GNF2、GNF5均可以显着抑制PEDV复制,并随着抑制剂工作浓度的增加抗病毒效果越明显,提示Abl2参与了病毒的复制过程。通过在病毒感染的不同时间加入Abl2特异性抑制剂,证明Abl2影响PEDV复制主要发生于病毒入侵阶段,但不影响病毒的吸附过程。同时,加入Abl2抑制剂后通过间接免疫荧光观察病毒诱导细胞形成的合胞体明显变小,合胞体数量也减少。外源性表达PEDV S蛋白后加入Abl2抑制剂实验进一步确定了Abl2影响PEDV S蛋白介导的细胞间合胞体的形成从而促进病毒的复制。另外,Abl2酶抑制剂imatinb、GNF2、GNF5对猪肠道冠状病毒具备广谱性抑制作用,加入抑制剂后可以显着抑制TGEV、PDCoV在ST细胞中的感染,并同样抑制病毒的入侵及细胞合胞体的形成。为研究PEDV感染过程中Vero E6细胞差异表达的miRNA对病毒的调控作用,应用miRNA mimic/inhibitor实验筛选影响PEDV复制的miRNA。结果发现miR-486-5p、miR-339-5p、miR-1271-5p可以显着抑制病毒复制,而miR-33a可以促进病毒复制。应用RT-qPCR、双荧光素酶报告系统等手段筛选出miR-486-5p在PEDV感染过程中起调控作用的靶基因是SRSF3,上调表达SRSF3促进病毒的感染而沉默SRSF3抑制病毒的复制。另外SRSF3并不是通过与PEDV N蛋白发生相互作用而影响病毒复制,其具体机制有待进一步探索。本研究构建了PEDV感染Vero E6细胞mRNA/miRNA表达谱,并发现Abl2在PEDV入侵阶段发挥调控作用,同时筛选出影响PEDV复制的miRNA,对挖掘新的PEDV药物靶点进而提供新的抗病毒策略具有重要的借鉴意义。
石达[9]（2020）在《猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究》文中进行了进一步梳理冠状病毒（Coronavirus,CoVs）这一大类病毒广泛存在于自然界中,常见禽类、哺乳动物以及人类都易感。自2003年SARS-CoV（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV）的流行到2012年的MERS-CoV（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）的出现,再到2020年最大的“黑天鹅事件”-新型冠状病毒疫情的暴发,均引起了全世界人类的恐慌。2010-2013年猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）以及2017年新发现的猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）,更是重创了世界畜牧业,至此,人们才对冠状病毒感染后致病的严重程度以及快速的传播能力给予了足够的重视。SADS-CoV作为一种新发现的冠状病毒,属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属,是有囊膜包被的单股正链RNA病毒。自2017年首次在中国猪场发现和报道以来,已经在广东清远地区猪场引发了严重的仔猪腹泻疫情。病毒作为一种专性细胞内寄生物,其在感染过程中必定会与宿主的胞内应答发生相互作用。细胞自噬（Autophagy）作为一种保守的胞内适应性应答,在维持细胞稳态,促进新陈代谢方面起着举足轻重的作用。它可将细胞内的衰老细胞器、外源微生物等成分包裹在一个称为自噬体的双层膜结构中,运送至溶酶体进行降解回收。自噬是机体对抗病原体的天然防御机制,但最近越来越多的证据表明许多病毒已进化出多种策略抵抗、逃逸、甚至利用细胞自噬促进自身增殖,如流感病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、轮状病毒等。对于SADS-CoV而言,其复制感染与细胞自噬之间的相互作用及其启动机制便是本研究中要探索的问题。首先,采用三种经典方法对SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后是否诱导自噬进行了检测,包括透射电镜观察自噬体的形成,激光共聚焦检测荧光聚点的变化以及Western blot分析LC3的转化。结果表明,与对照相比,SADS-CoV感染后诱导Vero E6细胞产生自噬体样双层膜结构,GFP-LC3荧光聚点显着累积,而且LC3发生了明显的类别转换,同时证明SADS-CoV诱导的自噬严格依赖于病毒的复制,由此证实SADS-CoV感染可以诱导细胞自噬的发生。其次,进一步研究了细胞自噬对病毒复制的影响。结果显示利用自噬诱导剂Rapamycin处理细胞诱导自噬反应后,上调了病毒的复制;利用自噬阻断剂3-MA处理细胞降低自噬反应后,下调了病毒的复制。敲低自噬关键性基因ATG5和LC3抑制自噬后,病毒N蛋白表达显着的减少,同时上清中子代病毒的含量也显着的降低。上述结果证明了SADS-CoV的有效复制是诱导自噬的关键因素,并可以利用自噬促进自身增殖。再次,对SADS-CoV是否诱导完整自噬潮进行了分析。自噬潮,即自噬的整个动态连续的过程,可通过p62的降解、LC3-Ⅱ的周转、自噬小体和溶酶体共定位分析等综合评价。研究结果显示,SADS-CoV感染促进了自噬底物p62的降解;3D活细胞激光共聚分析发现SADS-CoV感染促进了自噬小体和溶酶体的融合;同时SADS-CoV感染后GFP-LC3标记的自噬小体和LysoTracker标记的溶酶体出现了明显的共定位;最后配合使用溶酶体抑制剂CQ,发现LC3-Ⅱ和p62出现了明显的蓄积,以上结果表明SADS-CoV感染诱导了自噬的起始和自噬性降解过程,即SADS-CoV感染可诱导完整的自噬潮。最后,为了深入探索SADS-CoV感染激活自噬的机制,本研究对内质网应激与自噬之间关系进行了系统分析。结果显示SADS-CoV感染在体内和体外均能诱导内质网应激,同时可激活PERK-EIF2S1、ATF6和IRE1三条信号通路,进一步利用特异性抑制剂或激活剂,RNA干扰和关键蛋白过表达发现仅IRE1信号通路在SADS-CoV诱导细胞自噬过程中起到关键性作用。综上所述,本研究阐明了（1）SADS-CoV感染诱导Vero E6和ST细胞自噬;（2）自噬过程有利于SADS-CoV的复制;（3）SADS-CoV可通过UPR的IRE1信号途径激活自噬。研究结果推动了SADS-CoV与宿主相互作用领域的研究,为探索SADS-CoV发病机制提供了全新的视角,为抗病毒药物的筛选奠定了基础。
张帆帆[10]（2020）在《PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究》文中研究表明病毒性腹泻一直是困扰生猪养殖的重要疾病之一,疾病主要引起一周龄以内的仔猪呕吐、水样腹泻和脱水死亡。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是致仔猪死亡的头号杀手,感染率高达60%,死亡率可达100%;猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）为仅次PEDV的猪肠道致病原,其感染率高达30%,死亡率高达50%以上。猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）又名猪肠道阿尔法冠状病毒（porcine enteric alphacoronavirus,PEAV）/猪肠道α冠状病毒（Se A-CoV）,是2017年初新发现的一种新型致病性肠道冠状病毒,临床发病时间比PEDV稍晚2-3天,临床症状也相较于PEDV要轻。中国是生猪养殖大国,年出栏生猪达7亿头,然后却未见对于南方地区PEDV、PDCoV、SADS-CoV流行病学和基因的遗传变异的长期观察,且临床上存在大量PEDV和PDCoV混合感染的病例,其致病机制尚未明晰。为此本研究主要针对以下几个方面进行研究:1、南方地区PEDV、PDCoV和SADS-CoV的流行情况调查及S1基因的遗传变异情况从江西、浙江、福建、广东、湖南五省份采集了2012-2019年间3051份粪便、小肠组织及母乳样品,使用本实验建立的RT-PCR方法对样品中PEDV、PDCoV、SADS-CoV进行流行病学调查,结果表明:PEDV阳性率最高,阳性率为57.06%;其次为PDCoV,阳性率为27.14%;SADS-CoV的阳性率最低,仅为0.23%,且仅福建地区的样品中检测出了SADS-CoV阳性样品的存在。在2012-2019年间,PEDV的阳性率一直维持在较高水平,2013年PEDV的阳性率最高,达62.13%,而2019年的PEDV阳性率最低,为45.31%;PDCoV的阳性率在2018年最高,2012年最低;而SADS-CoV仅在2017年福建采集的68份样品有检出,总阳性率为0.23%。在混合感染的样品中,PEDV和PDCoV混合感染样品数最多,最高可占17.33%;而在PDCoV阳性样品中,PEDV和PDCoV混合感染率最高为70.97%,最低为2014年的样品,为30.57%。挑选11株不同年份PEDV阳性样品进行的S1基因进行核苷酸与氨基酸进化树分析,结果表明:所扩增的PEDV S1基因均属于G IIa分支,证明华中地区主要流行G IIa毒株;且具有A518S、G521D、L522H/Y、S524G、V528I、T550S、S563F、G594S、A605E、L612F、F617L、K630T、E633V和I635V的突变为位点。挑选的8株PDCoV氨基酸进化树分析发现:扩增的PDCoV毒株以及所有中国毒株（AN-2004除外）和泰国毒株（TT＿1115）在N52处均具有氨基酸缺失。扩增的SADS-CoV-CH-NDFJ-2018S1基因与Gen Bank中41株参考株的核苷酸同源性均在97.2%-100%之间,氨基酸同源性在98%-100%;其中与SADS-CoV-CH-FJWT-2018（MH615810）毒株的同源性最低,与SADS-CoV＿GDLX/2019（MK651076）同源性最高。2、PEDV、PDCoV与SADS-CoV感染IPEC-J2细胞的生物学特性研究以IPEC-J2细胞为感染模型,使用PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2细胞,通过数据统计发现,PEDV单一感染IPEC-J2病毒拷贝数比PEDV+PDCoV及PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显着增加,说明共感染抑制/影响PEDV病毒的增殖。在PEDV+PDCoV共感染中PEDV的病毒拷贝数比PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显着降低,说明在共感染中PDCoV比SADS-CoV对PEDV增殖的影响要更为强烈。而PDCoV与PEDV或SADS-CoV共同感染时PDCoV的病毒拷贝数显着高于PDCoV单一感染时拷贝数,类似的现象在SADS-CoV病毒单一及与PEDV或PDCoV共感染中观察到。通过细胞免疫荧光还发现,不同病毒可以感染同一细胞,不存在排斥现象。3、PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染转录组学比较研究通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,进一步揭示PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染的病毒致病机制和宿主的抗病毒机制的差异。在与PEDV的共感染与单一感染对比中,PEDV+SADS-CoV共感染在前期比PEDV+PDCoV共感染会引起细胞更加强烈的免疫反应,而PEDV+PDCoV共感染在后期诱导的炎症免疫反应强于PEDV+SADS-CoV;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PEDV+SADS-CoV差异基因主要富集在细胞进中的氨基化合物的生物合成进程（amide biosynthetic process）、ATP生物合成进程（ATP biosynthetic process）和ATP代谢进程（ATP metabolic process）均显着升高,而在PEDV+PDCoV差异基因主要富集在固有免疫应答（innate immune response）、固有系统应答（immune system process）和免疫应答（immune response）中。在与PDCoV的共感染与单一感染对比中,PDCoV+SADS-CoV和PDCoV+PEDV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数均不断上升;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PDCoV+SADS-CoV比PDCoV+PEDV引起的细胞信号通路的变化更为显着,且聚类的通路有所差异。在24h时,PDCoV+SADS-CoV差异基因富集中固有免疫应答（innate immune response）、细胞因子应答（response to cytokine）、肿瘤坏死因子应答（response to tumor necrosis factor）等最显着,而PDCoV+PEDV差异基因富集中免疫系统进程、免疫应答、固有免疫应答等最显着。在与SADS-CoV的共感染与单一感染对比中,SADS-CoV+PDCoV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数不断上升,而SADS-CoV+PEDV共感染组在48h时差异基因数有所下降。对表达差异基因进行生物信息分析发现,通过对不同时间点,对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PDCoV共感染组GO富集分析:在6 h和24 h时,均无显着差异性通路富集;在48h时,有281个差异基因显着富集到细胞组分,仅微管细胞骨架（microtubule cytoskeleton）、细胞核（nucleus）、微管形成中心（microtubule organizing center）和中心体（centrosome）通路差异显着。对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PEDV共感染组GO富集分析:在6 h时,有38个富集通路显着差异,其中病毒免疫应答相关通路差异显着,涉及的相关差异基因为RSAD2、MX1、DDX58、MX2、STAT1、OAS1、STAT2、CD40、IRF1、CCL5、ISG20等;在24 h和48 h没有发现显着差异富集通路。我们首次对通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,研究结果为深入了解单一感染和共感染对宿主免疫应答机制的改变提供基础。4、TLR3通路对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响TLR3是一种病原的模式识别受体,识别病毒感染产生的双链RNA结构后,通过诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的生成,抑制病毒的复制。在进行转录组富集分析发现TLR3通路在单一感染和共感染组均出现显着上调。本实验在病毒感染前后使用poly（I:C）刺激IPEC-J2细胞发现,病毒感染前12h刺激对病毒复制的抑制效果更为显着;而使用BX795抑制TLR3通路的激活,可以促进病毒的复制。为了进一步确定是由于病毒感染激活TLR3引起宿主的免疫应答反应,使用pCAGGS-TLR3过表达质粒和pCDNA3.1-U6-TLR3干扰质粒分别转染IPEC-J2细胞,发现TLR3的过表达抑制了病毒的复制,并且引起了更加强烈的干扰素的产生,反之则降低了TLR3通路的激活促进了病毒的复制。5、PEDV、SADS-CoV和PDCoV结构蛋白与INSIG1相互作用机制在病毒感染宿主细胞的过程中,除了利用病毒自身的蛋白在一定程度上抑制宿主的免疫应答,还能在病毒感染期间调节固醇的合成作为促进脂质筏中病毒复制和病毒出芽的策略。胰岛素诱导基因（Insulin-induced genes,INSIGs）是近年来新发现的调控细胞固醇类物质合成与代谢的主要因子,病毒依靠其细胞宿主为成功复制提供能量和组成元件。为了探究PEDV、PDCoV、SADS-CoV影响胆固醇代谢机制,本实验利用病毒蛋白的过表达重组质粒转染IPEC-J2细胞,研究INSIG1与PEDV、PDCoV、SADS-CoV之间的相互关系。通过实验发现,INSIG1 mRNA水平和蛋白水平在PDCoV感染后期出现显着下调,而PEDV、SADS-CoV则出现显着上调,这促使我们对其感染机制的不同做出更深入研究。在本实验中,INSIG1过表达可以降低腹泻相关病毒的病毒拷贝数;INSIG1敲低可以显着促进病毒的表达。通过共感染的研究发现,与PDCoV的可以在一定程度上促进PEDV和SADS-CoV的增殖。因此,PEDV、PDCoV、SADS-CoV产生的蛋白可能会对INSIG1基因产生抑制作用。过表达三种病毒的结构蛋白和非结构蛋白的研究发现,病毒S蛋白可以显着抑制INSIG1的表达,而其他非结构基因ORF3、NS3、NS6、NS7、NS7a、NS7b可在一定程度上引起INSIG1的上调,存在一定的中和调节作用。这与病毒感染前期,INSIG1出现一定程度的上调有一定关系。为了进一步了解在感染的后期PEDV、SADS-CoV和PDCoV感染的IPEC-J2细胞INSIG1出现显着差异的原因,使用不同浓度的葡糖糖培养基培养三种病毒发现,INSIG1基因的表达水平的变化,依赖于葡糖糖浓度的影响。通过测定胆固醇代谢相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1、INSIG2、DHCR24、LSS、MSMO1、OSBPL8变化水平发现,PDCoV感染组胆固醇合成相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1出现显着下调,氧化固醇结合蛋白样蛋白8（Oxysterol Binding Protein Like Protein,OSBPL8）则显着上调。该研究为PEDV、PDCoV和SADS-CoV的相互作用及病毒和胆固醇代谢建立了新的联系,为将来研究PEDV、PDCoV和SADS-CoV共感染机制提供新的依据。
二、SARS-CoVS2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS-CoVS2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）猪整合素αvβ1在PEDV感染过程中作用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻概述 |
| 1.2 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.2.1 猪流行性腹泻病毒形态结构及基因组 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻病毒的结构与生物学特性 |
| 1.3 PEDV感染相关蛋白 |
| 1.3.1 猪氨基肽酶N |
| 1.3.2 唾液酸 |
| 1.3.3 其他蛋白 |
| 1.4 整合素的研究进展 |
| 1.4.1 整合素的结构 |
| 1.4.2 整合素的功能 |
| 1.4.3 整合素与病毒感染 |
| 1.4.4 整合素与PEDV感染 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 猪整合素β1多克隆抗体的制备 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪整合素β1基因合成及鉴定 |
| 2.2.2 猪整合素β1重组基因表达及纯化 |
| 2.2.3 猪整合素β1重组蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.4 猪整合素β1重组蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 猪整合素β1重组蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 2.2.6 猪整合素β1多克隆抗体的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪整合素β1跨膜区及抗原性分析 |
| 2.3.2 猪整合素β1基因表达及纯化 |
| 2.3.3 猪整合素β1重组蛋白的鉴定 |
| 2.3.4 猪整合素β1多克隆抗体效价的检测 |
| 2.3.5 猪整合素β1多克隆抗体的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 猪整合素β1真核表达载体构建及αvβ1对PEDV感染作用的研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 pCAGGS-piβ1真核表达载体构建 |
| 3.2.2 细胞培养与病毒接种 |
| 3.2.3 细胞转染 |
| 3.2.4 siRNA合成 |
| 3.2.5 RNA提取及cDNA合成 |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR |
| 3.2.7 免疫印迹分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪整合素β1合成重组质粒的鉴定 |
| 3.3.2 猪整合素β1真核重组质粒构建及鉴定 |
| 3.3.3 猪整合素αvβ1在VeroE6细胞中的过表达 |
| 3.3.4 过表达猪整合素αvβ1对PEDV感染的影响 |
| 3.3.5 沉默整合素αvβ1对PEDV感染的影响 |
| 3.3.6 猪整合素αvβ1对PEDV黏附及内化阶段的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪急性腹泻综合征概述 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 基因组结构及功能 |
| 1.1.4 诊断与防控 |
| 1.2 抗体 |
| 1.2.1 单克隆抗体 |
| 1.3 抗原表位研究进展 |
| 1.3.1 B细胞抗原表位研究方法 |
| 1.3.2 T细胞抗原表位研究方法 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 SADS-CoV N蛋白的基因克隆、表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株、菌株 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SADS-CoV N蛋白原核表达重组质粒的构建 |
| 2.2.2 SADS-CoV N蛋白的表达、鉴定及纯化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV N蛋白基因扩增 |
| 2.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.3 N蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 相关溶液的配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠免疫 |
| 3.2.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.3 细胞融合 |
| 3.2.4 阳性杂交瘤的筛选和克隆 |
| 3.2.5 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.6 单克隆抗体腹水的制备以及抗体效价的测定 |
| 3.2.7 杂交瘤细胞及MAbs特性的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 MAbs亚类的鉴定 |
| 3.3.4 MAbs抗体效价检测 |
| 3.3.5 MAbs反应原性检测 |
| 3.3.6 MAbs特异性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒株、菌株、细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 间接免疫荧光 |
| 4.2.2 免疫组织化学染色 |
| 4.2.3 亚细胞定位试验 |
| 4.2.4 免疫共沉淀实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗SADS-CoV N蛋白间接免疫荧光检测 |
| 4.3.2 免疫组织化学染色 |
| 4.3.3 亚细胞定位实验 |
| 4.3.4 免疫共沉淀实验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 SADS-CoV N蛋白单克隆抗体的抗原表位的鉴定 |
| 5.1 实验材料及方法 |
| 5.1.1 病毒株、菌株、细胞株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 SADS-CoV N蛋白短肽设计 |
| 5.2.2 抗原表位的初步鉴定 |
| 5.2.3 抗原表位的精确定位 |
| 5.2.4 抗原表位的保守性分析和特异性分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 N蛋白的抗原表位短肽设计 |
| 5.3.2 N蛋白的截短表达及表位筛选 |
| 5.3.3 N蛋白抗原表位的保守性和特异性分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 PED的概述 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 PEDV生物学特性 |
| 1.2 细胞周期调控的研究进展 |
| 1.2.1 细胞周期的概述 |
| 1.2.2 细胞周期的调控 |
| 1.3 p53 与细胞周期 |
| 1.3.1 p53 与细胞周期调控 |
| 1.3.2 p53-DREAM与细胞周期调控 |
| 1.4 冠状病毒感染与细胞周期 |
| 1.4.1 冠状病毒感染与细胞周期调控 |
| 1.4.2 冠状病毒N蛋白与细胞周期调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、菌株、细胞 |
| 2.1.2 血清、载体 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 试剂配方 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 RNA 的提取及c DNA 的合成 |
| 2.2.2 基因扩增 |
| 2.2.3 重组质粒的构建及大量制备 |
| 2.2.4 原核表达、纯化及去标签化 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 流式细胞术 |
| 2.2.10 细胞周期同步化 |
| 2.2.11 接种病毒及TCID50 检测 |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.13 激光共聚焦 |
| 2.2.14 重组慢病毒的构建 |
| 2.2.15 分子对接分析 |
| 2.2.16 生物膜干涉技术(BLI)分析 |
| 2.2.17 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.18 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.1.1 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.1.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞对PEDV复制的影响 |
| 3.2 PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞分子机制研究 |
| 3.2.1 PEDV N蛋白通过激活p53-DREAM信号通路引起Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.2.2 PEDV N 蛋白诱导Vero E6 细胞S期阻滞依赖于N 蛋白和p53 核共定位 |
| 3.2.3 PEDV N蛋白通过与p53 相互作用介导Vero E6 细胞S期阻滞 |
| 3.3 基于PEDV N蛋白介导S期阻滞机制的抗病毒药物设计 |
| 3.3.1 抑制PEDV N蛋白与p53 相互作用小分子药物的筛选 |
| 3.3.2 筛选的小分子药物拮抗PEDV N蛋白介导Vero E6 细胞S期阻滞的确证 |
| 3.3.3 金丝桃苷对PEDV复制抑制作用 |
| 3.4 PEDV N蛋白介导S期阻滞分子机制在仔猪肠道细胞IPEC-J2 上验证 |
| 3.4.1 PEDV N蛋白对IPEC-J2 细胞S期阻滞的确证以及对病毒复制的影响 |
| 3.4.2 PEDV N蛋白通过p53-DREAM信号通路介导IPEC-J2 细胞S期阻滞的验证 |
| 3.4.3 金丝桃苷拮抗PEDV N蛋白介导IPEC-J2 细胞S期阻滞抑制病毒复制的验证 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 冠状病毒概述 |
| 1.1.1 冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 冠状病毒基因组结构 |
| 1.1.3 猪冠状病毒 |
| 1.2 猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 SADS-CoV的分类地位 |
| 1.2.2 SADS-CoV的流行病学及传播途径 |
| 1.2.3 SADS-CoV的病毒粒子及基因组结构 |
| 1.2.4 SADS-CoV的细胞培养及传代 |
| 1.2.5 SADS-CoV的临床症状及病理变化 |
| 1.2.6 SADS-CoV的诊断方法 |
| 1.3 细胞凋亡 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 细胞凋亡的过程 |
| 1.3.3 细胞凋亡与细胞坏死的区别 |
| 1.3.4 细胞凋亡的生理意义 |
| 1.3.5 细胞凋亡的发生途径 |
| 1.4 病毒感染与细胞凋亡 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 猪急性腹泻综合征冠状病毒感染诱导细胞凋亡 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病毒、细胞和抗体 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 超微结构观察 |
| 2.2.2 SADS-CoV感染Vero E6细胞的病变观察 |
| 2.2.3 DNA Ladder检测 |
| 2.2.4 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 Western blot检测相关蛋白 |
| 2.2.7 间接免疫荧光 |
| 2.2.8 药物配制及细胞处理 |
| 2.2.9 激光共聚焦观察 |
| 2.2.10 细胞线粒体分离 |
| 2.2.11 CCK-8试验检测药物对细胞活性的影响 |
| 2.2.12 SADS-CoV TCID_(50)测定 |
| 2.2.13 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV感染诱导Vero E6和IPI-2I细胞凋亡 |
| 2.3.2 SADS-CoV感染激活Caspase相关蛋白并裂解PARP |
| 2.3.3 抑制SADS-CoV诱导的凋亡后病毒复制减弱 |
| 2.3.4 SADS-CoV感染同时激活内源性和外源性凋亡途径 |
| 2.3.5 SADS-CoV感染诱导凋亡是经过Fas/FasL依赖性途径 |
| 2.3.6 SADS-CoV感染促进Bax和Cyt c转位 |
| 2.3.7 SADS-CoV感染Vero E6细胞后AIF不发生重新定位 |
| 2.3.8 CsA抑制SADS-CoV诱导的细胞凋亡并减弱病毒复制 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）携带sgRNA/ASFV p30-CRISPR/Cas9的rPRV的构建及初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟 |
| 1.1.1 危害和流行特点 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒分子生物学 |
| 1.1.3 疫苗研究进展 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 基因编辑技术简介 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在ASFV防控中的应用 |
| 1.3 伪狂犬病毒活载体疫苗 |
| 1.3.1 PRV基因组结构 |
| 1.3.2 伪狂犬病毒活载体疫苗研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 携带sgRNA/ASFV p30-CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建及初步鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂及载体 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 p30 真核表达红色荧光报告质粒的构建 |
| 2.2.2 针对非洲猪瘟病毒p30 基因CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建 |
| 2.2.3 sgRNA的活性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 p30 真核表达红色荧光报告质粒的构建结果 |
| 2.3.2 针对非洲猪瘟病毒p30 基因CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建的结果 |
| 2.3.3 sgRNA的活性分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 携带sgRNA/ASFV p30-CRISPR/Cas9 基因编辑系统r PRV的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞与病毒 |
| 3.1.2 主要试剂与载体 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Bartha K61 左右同源臂的扩增 |
| 3.2.2 pc DNA3.1 真核转移载体的构建 |
| 3.2.3 表达靶向ASFV p30 基因的CRISPR/Cas9 真核转移载体的构建 |
| 3.2.4 表达针对ASFV p30 基因的CRISPR/Cas9 编辑系统的重组伪狂犬病毒的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Bartha K61左右同源臂扩增结果 |
| 3.3.2 PRV真核转移载体的构建结果 |
| 3.3.3 表达靶向ASFV p30基因的CRISPR/Cas9真核转移载体的构建结果 |
| 3.3.4 表达针对ASFV p30基因CRISPR/Cas9编辑系统的重组伪狂犬病毒的构建结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组K61-Cas9毒株对p30真核报告质粒表达的影响研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞与病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组病毒K61-Cas9在Vero E6 细胞上的增殖特性观察 |
| 4.2.2 重组病毒K61-Cas9 的遗传稳定性测定 |
| 4.2.3 重组病毒K61-Cas9 的生长动力学测定 |
| 4.2.4 重组病毒K61-Cas9对p30红色荧光融合表达质粒的表达影响 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组病毒K61-Cas9在Vero E6 细胞上的增殖特性观察结果 |
| 4.3.2 重组病毒K61-Cas9 的遗传稳定性测定结果 |
| 4.3.3 重组病毒K61-Cas9 的生长动力学测定结果 |
| 4.3.4 重组病毒K61-Cas9对p30红色荧光融合表达质粒的表达影响结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A sgRNA序列连接载体的鉴定结果 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒研究概况 |
| 1.1.1 PEDV流行病学及分子特征 |
| 1.1.2 S蛋白的免疫原性 |
| 1.1.3 黏膜免疫 |
| 1.1.4 PEDV受体研究 |
| 1.1.5 冠状病毒S蛋白三聚体结构解析 |
| 1.1.6 N蛋白 |
| 1.1.7 诊断方法 |
| 1.2 发光元素 |
| 1.3 抗体治疗 |
| 1.3.1 抗体介导的中和作用机制 |
| 1.3.2 PEDV中和性抗体及其表位研究 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA间接ELISA检测方法的建立及应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 细胞、毒株、试验动物、抗体和试剂 |
| 2.2.2 杂交瘤细胞复苏及单抗腹水的制备 |
| 2.2.3 抗体纯化及HRP标记 |
| 2.2.4 PEDV毒株的培养及纯化 |
| 2.2.5 IFA筛选阴性样品及阳性样品 |
| 2.2.6 间接ELISA反应条件的优化 |
| 2.2.7 临界值判定 |
| 2.2.8 特异性试验 |
| 2.2.9 敏感性试验 |
| 2.2.10 重复性实验 |
| 2.2.11 符合性实验及初步应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEDV LNCT2粒子的鉴定 |
| 2.3.2 IFA筛选阴性样品和阳性样品 |
| 2.3.3 最佳工作条件的确定 |
| 2.3.4 批内批间重复性实验 |
| 2.3.5 临界值的确定 |
| 2.3.6 特异性试验 |
| 2.3.7 敏感性试验 |
| 2.3.8 间接ELISA方法的符合性和初步应用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PEDV荧光快速检测试纸条的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 细胞、试验动物、抗体和试剂 |
| 3.2.2 PEDVN基因的扩增及重组质粒构建 |
| 3.2.3 重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.4 抗PEDVN蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.2.5 荧光纳米微球标记PEDV抗体 |
| 3.2.6 荧光纳米微球标记兔IgG抗体 |
| 3.2.7 试纸条的制备 |
| 3.2.8 临界值的判定 |
| 3.2.9 敏感性检测 |
| 3.2.10 特异性检测 |
| 3.2.11 流行病学调查 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PEDV N重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.2 稳定表达抗PEDV N蛋白的单克隆细胞株的筛选及鉴定 |
| 3.3.3 试纸条的组装及外观 |
| 3.3.4 临界值的判定 |
| 3.3.5 敏感性检测 |
| 3.3.6 试纸条的特异性检测 |
| 3.3.7 试纸条的临床应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 分泌中和PEDV的单克隆抗体细胞株的筛选及鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、试验动物、抗体和试剂 |
| 4.2.2 PEDV的培养和纯化 |
| 4.2.3 抗PEDV单克隆抗体的制备 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PEDV-LNCT2病毒粒子的纯化 |
| 4.3.2 抗PEDV单克隆抗体的制备 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 1B9单抗逃逸毒株的筛选及中和作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株和试剂 |
| 5.2.2 PEDV-LNCT2毒株的培养 |
| 5.2.3 PEDV多克隆抗体的制备 |
| 5.2.4 PEDV中和性单抗和多抗逃逸毒株的筛选 |
| 5.2.5 S基因序列测定及分析 |
| 5.2.6 关键氨基酸位点的确定 |
| 5.2.7 IFA检测 |
| 5.2.8 pAb与1B9单抗筛选的逃逸毒株的中和试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 中和抗体逃逸毒株筛选 |
| 5.3.2 突变毒株的S基因序列分析 |
| 5.3.3 缺失的氨基酸在PEDV S蛋白结构中的位置 |
| 5.3.4 mutant-1B9与pAb的中和试验 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的防治研究进展 |
| 1.1 PEDV的防治研究进展 |
| 1.2 TGEV的防治研究进展 |
| 1.3 ETEC的防治研究进展 |
| 2 scFv及噬菌体展示技术 |
| 2.1 抗体简介 |
| 2.2 scFv的分子结构 |
| 2.3 scFv的表达 |
| 2.4 scFv的筛选方法 |
| 2.5 scFv的应用 |
| 3 壳聚糖纳米制剂药物口服递送系统概述 |
| 3.1 口服治疗与纳米技术 |
| 3.2 壳聚糖 |
| 3.3 壳聚糖的改性 |
| 3.4 壳聚糖纳米药物载体制备方法 |
| 3.5 壳聚糖纳米制剂在生物医学领域的应用 |
| 4 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 4.1 LAB |
| 4.2 LAB载体系统 |
| 4.3 NICE表达系统 |
| 4.4 LAB的表达形式 |
| 4.5 LAB表达系统的应用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 猪源噬菌体-scFv库的构建和抗猪腹泻重要病原体scFv的筛选鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪抗体水平检测 |
| 2.2 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3 cDNA的合成 |
| 2.4 猪源scFv基因的扩增 |
| 2.5 猪源噬菌体-scFv库的构建 |
| 2.6 猪源噬菌体-scFv库的鉴定 |
| 2.7 PEDV和 TGEV全病毒抗原的制备 |
| 2.8 ETEC菌毛抗原的提取 |
| 2.9 M13KO7 辅助噬菌体的扩增 |
| 2.10 猪源噬菌体-scFv的富集筛选 |
| 2.11 噬菌体ELISA |
| 2.12 重组scFv蛋白的表达及纯化 |
| 2.13 免疫印迹 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪抗体水平检测 |
| 3.2 scFv的获得 |
| 3.3 猪源噬菌体-scFv库的构建和鉴定 |
| 3.4 病毒的浓缩纯化 |
| 3.5 ETEC K88ac菌毛的纯化 |
| 3.6 猪源噬菌体-scFv的筛选鉴定 |
| 3.7 噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.8 scFv的序列分析与纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 抗猪腹泻重要病原体scFv的生物学功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗PEDV和 TGEV scFv的特性分析 |
| 2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 间接免疫荧光 |
| 2.5 细胞样品处理 |
| 2.6 病毒滴度的测定 |
| 2.7 scFv中和实验 |
| 2.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 2.9 抗K88ac菌毛多克隆抗体的制备 |
| 2.10 黏附实验和黏附抑制实验 |
| 2.11 IPEC-J2 细胞的细胞因子测定 |
| 2.12 ETEC感染小鼠腹泻模型的建立 |
| 2.13 抗k88ac scFv对感染ETEC小鼠的保护作用研究 |
| 2.14 小鼠细胞因子水平的检测 |
| 2.15 小鼠肠道病理切片制作及HE染色 |
| 2.16 小鼠肠道病理形态的定量分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv的特异性实验 |
| 3.2 scFv的稳定性分析 |
| 3.3 scFv的亲和力分析 |
| 3.4 scFv的抗原结合位点分析 |
| 3.5 scFv的细胞毒性实验 |
| 3.6 scFv与病毒蛋白的结合 |
| 3.7 scFv的抗病毒作用分析 |
| 3.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 3.9 多克隆抗体ELISA效价检测 |
| 3.10 scFv对 ETEC黏附细胞的抑制作用分析 |
| 3.11 scFv对 ETEC诱导细胞因子表达的影响 |
| 3.12 小鼠腹泻模型的建立 |
| 3.13 scFv对小鼠腹泻的保护作用研究 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 壳聚糖纳米口服scFv制剂及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CMCS纳米制剂的制备 |
| 2.2 表征分析 |
| 2.3 纳米制剂的包封率及载药量的测定 |
| 2.4 scFv在纳米制剂中的完整性 |
| 2.5 纳米制剂在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 2.6 scFv释放实验 |
| 2.7 纳米制剂的生物安全性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 CMCS的制备 |
| 3.2 纳米制剂的表征 |
| 3.3 载药率与包封率 |
| 3.4 scFv在纳米材料中的完整性 |
| 3.5 scFv在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 3.6 scFv的释放实验 |
| 3.7 纳米制剂的生物安全性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 scFv纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 scFv的纯化制备 |
| 2.2 CMCS/CS-scFv和 scFv的口服鉴定 |
| 2.3 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用研究 |
| 2.4 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用研究 |
| 2.5 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用研究 |
| 2.6 scFv纳米制剂联合使用对仔猪感染腹泻病原的保护作用研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 口服CMCS/CS-scFv和 scFv在肠道的分布 |
| 3.2 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用 |
| 3.3 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用 |
| 3.4 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用 |
| 3.5 纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对腹泻病原体混合感染的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 分泌表达scFv的乳酸乳球菌制备及其保护功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分泌表达scFv 的重组L.lactis-scFv 的构建 |
| 2.2 L.lactis电转化感受态细胞制备 |
| 2.3 L.lactis的电转化 |
| 2.4 重组L.lactis-scFv对模拟胃肠道环境的耐受性及生长曲线 |
| 2.5 重组L.lactis-scFv对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 2.6 重组L.lactis-scFv对仔猪肠道的黏附 |
| 2.7 重组L.lactis-scFv的诱导表达 |
| 2.8 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能分析 |
| 2.9 重组L.lactis-scFv分泌scFv的动物保护功能分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv分泌表达载体的构建 |
| 3.2 重组L.lactis-scFv的生长特性 |
| 3.3 重组L.lactis-scFv的黏附特性 |
| 3.4 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能鉴定 |
| 3.5 重组L.lactis-scFv的动物保护作用鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用溶液的配制 |
| 附录二 补充图 |
| 附录三 补充表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 授权的发明专利 |
（8）PEDV感染Vero E6细胞mRNA/miRNA表达谱分析及Abl2影响病毒复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病原学概述 |
| 1.1.1 PEDV结构与生物学特性 |
| 1.1.2 PEDV在中国的流行情况 |
| 1.1.3 PEDV的防控与治疗 |
| 1.2 PEDV入侵宿主细胞机制进展 |
| 1.3 冠状病毒mRNA翻译机制 |
| 1.3.1 冠状病毒mRNA翻译具有Cap结构依赖性 |
| 1.3.2 冠状病毒IRES介导的翻译 |
| 1.3.3 宿主与病毒蛋白调节冠状病毒mRNA的翻译 |
| 1.4 转录组学概述 |
| 1.5 miRNA研究进展 |
| 1.5.1 miRNA生物学概述 |
| 1.5.2 miRNA的生物合成 |
| 1.5.3 miRNA介导的mRNA降解机制 |
| 1.5.4 miRNA与病毒感染 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 第二章 PEDV感染Vero E6 细胞mRNA/miRNA表达谱分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要实验试剂 |
| 2.1.2 毒株、细胞和抗体 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 构建PEDV感染mRNA/miRNA表达谱测序细胞的筛选 |
| 2.2.1.1 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.1.2 半数感染量的测定(TCID_(50)) |
| 2.2.1.3 荧光定量PCR检测病毒载量 |
| 2.2.2 PEDV感染细胞mRNA/miRNA高通量测序 |
| 2.2.3 转录组测序结果分析 |
| 2.2.3.1 测序质量分析与表达差异分析 |
| 2.2.3.2 差异表达基因功能富集分析 |
| 2.2.4 转录组测序结果验证 |
| 2.2.4.1 RT-qPCR验证差异表达mRNA变化 |
| 2.2.4.2 RT-qPCR验证干扰素刺激基因差异表达 |
| 2.2.4.3 Western blot验证MAPK通路变化 |
| 2.2.5 miRNA表达差异分析 |
| 2.2.6 miRNA高通量测序结果验证 |
| 2.2.6.1 miRNA提取与反转录 |
| 2.2.6.2 miRNA RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEDV感染靶细胞的筛选 |
| 2.3.1.1 间接免疫荧光实验 |
| 2.3.1.2 TCID_(50)的测定 |
| 2.3.1.3 荧光定量PCR检测病毒载量 |
| 2.3.2 转录组测序结果分析 |
| 2.3.2.1 转录组测序结果整理与质量分析 |
| 2.3.2.2 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2.3 差异表达基因功能GO富集分析 |
| 2.3.2.4 KEGG细胞通路富集分析 |
| 2.3.3 PEDV感染差异表达mRNA验证 |
| 2.3.3.1 RT-qPCR验证主要差异表达mRNA |
| 2.3.3.2 RT-qPCR验证差异表达ISGs |
| 2.3.3.3 PEDV感染激活MAPK信号通路 |
| 2.3.4 PEDV感染Vero E6 细胞miRNA表达规律 |
| 2.3.4.1 原始数据统计及过滤 |
| 2.3.4.2 差异表达miRNA分析 |
| 2.3.4.3 差异表达miRNA候选靶基因GO富集分析 |
| 2.3.4.4 差异表达miRNA候选靶基因KEGG富集分析 |
| 2.3.5 加poly(A)尾法RT-qPCR验证miRNA测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PEDV感染后差异mRNA表达规律分析 |
| 2.4.2 miRNA与 mRNA表达谱联合分析 |
| 第三章 Abl2 影响PEDV复制机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞、质粒和病毒 |
| 3.1.2 抗体、试剂盒、抑制剂 |
| 3.1.3 敲低Abl2对PEDV复制的影响 |
| 3.1.3.1 RNAi干扰实验 |
| 3.1.3.2 抑制剂实验 |
| 3.1.4 抑制剂加入时间对PEDV复制的影响 |
| 3.1.5 IFA检测PEDV介导的细胞融合 |
| 3.1.6 Abl2对其他猪肠道冠状病毒感染的影响 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 siRNA下调Abl2 表达抑制PEDV的增殖 |
| 3.2.2 Abl2 抑制剂可显着抑制PEDV复制 |
| 3.2.3 Abl2 不影响PEDV吸附过程 |
| 3.2.4 Abl2 影响PEDV复制早期阶段 |
| 3.2.5 Imatinb在病毒入侵阶段抑制PEDV复制 |
| 3.2.6 Abl2 抑制剂抑制PEDV诱导的合胞体的形成 |
| 3.2.7 Abl2对猪肠道冠状病毒复制的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 影响PEDV复制miRNA的筛选及其靶基因的验证 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞、毒株和载体 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 影响PEDV复制差异表达miRNA筛选 |
| 4.1.4 miR-486-5p靶基因的预测 |
| 4.1.5 miR-486-5p靶基因的验证 |
| 4.1.5.1 双荧光素酶报告系统检测miR-486-5p与靶基因3’UTR结合 |
| 4.1.5.2 RNAi干扰靶基因对PEDV复制的影响 |
| 4.1.6 RT-qPCR检测PEDV感染后SRSF3 mRNA表达水平变化 |
| 4.1.7 敲低SRSF3对PEDV复制的影响 |
| 4.1.8 过表达SRSF3对PEDV复制的影响 |
| 4.1.8.1 SRSF3真核表达载体的构建 |
| 4.1.8.2 SRSF3 转染Vero E6 细胞 |
| 4.1.8.3 PEDV感染过表达SRSF3 Vero E6 细胞 |
| 4.1.9 激光共聚焦实验 |
| 4.1.10 免疫共沉淀实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 影响PEDV复制的差异表达miRNA初步筛选 |
| 4.2.2 miR-486-5p抑制PEDV复制 |
| 4.2.3 miR-486-5p与靶基因互作网络图的构建 |
| 4.2.4 miR-486-5p靶基因的验证 |
| 4.2.4.1 RT-qPCR验证miR-486-5p的靶基因 |
| 4.2.4.2 双荧光素酶报告系统验证miR-486-5p的靶基因 |
| 4.2.4.3 敲低miR-486-5p候选靶基因对PEDV复制的影响 |
| 4.2.5 SRSF3在PEDV感染过程中显着上调 |
| 4.2.6 敲低SRSF3抑制PEDV的复制 |
| 4.2.7 过表达SRSF3促进PEDV的复制 |
| 4.2.8 SRSF3与PEDV N蛋白不发生相互作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 冠状病毒概述 |
| 1.2 猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 SADS-CoV致病的临历床症状 |
| 1.2.2 宏基因组学分析 |
| 1.2.3 SADS-CoV的分子特征 |
| 1.2.4 SADS-CoV感染宿主细胞受体研究 |
| 1.2.5 SADS-CoV动物回归试验 |
| 1.2.6 SADS-CoV诊断方法的研究 |
| 1.3 自噬的研究进展 |
| 1.3.1 自噬的生物学功能和分子机制 |
| 1.3.2 自噬的检测方法 |
| 1.4 自噬的信号调节 |
| 1.5 病毒感染与自噬的相互关系 |
| 1.5.1 自噬的抗病毒作用 |
| 1.5.2 自噬对病毒复制的促进 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 SADS-CoV感染通过UPRIRE1通路诱导自噬并促进病毒的复制 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 相关溶液配制 |
| 2.2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 利用透射电镜观察自噬体 |
| 2.2.4 pAcGFP-LC3B转染细胞检测病毒对LC3的影响 |
| 2.2.5 Western blot对病毒蛋白及自噬相关基因的检测 |
| 2.2.6 激光共聚焦观察 |
| 2.2.7 3D活细胞成像 |
| 2.2.8 药物配制及细胞处理 |
| 2.2.9 CCK-8试验检测药物对Vero E6及ST细胞活性的检测 |
| 2.2.10 siRNA干扰 |
| 2.2.11 蛋白过表达或siRNA干扰对病毒复制影响 |
| 2.2.12 SADS-CoV滴度的测定 |
| 2.2.13 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬小体的形成 |
| 2.3.2 SADS-CoV感染Vero E6细胞后自噬囊泡的形成 |
| 2.3.3 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞后LC3蛋白的转化 |
| 2.3.4 SADS-CoV复制过程参与诱导细胞自噬 |
| 2.3.5 诱导自噬促进SADS-CoV的复制,而抑制自噬降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.6 敲低自噬关键因子ATG5和LC3B降低SADS-CoV的复制 |
| 2.3.7 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞引起自噬底物p62的降解 |
| 2.3.8 SADS-CoV感染Vero E6诱导autolysosome的形成 |
| 2.3.9 SADS-CoV感染Vero E6后LysoTracker初LC3共定位分析 |
| 2.3.10 SADS-CoV感染Vero E6和ST细胞LC3-Ⅱ周转分析 |
| 2.3.11 SADS-CoV感染诱导内质网应激并激活PERK-EIF2S1、IRE1和ATF6三条通路 |
| 2.3.12 内质网应激参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.13 PERK-EIF2S1通路抑制SADS-CoV复制,但不参与SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.14 ATF6信号通路不影响SADS-CoV的复制及SADS-CoV诱导的细胞自噬 |
| 2.3.15 SADS-CoV通过激活IRE1信号通路诱导细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SADS-CoV感染诱导细胞自噬 |
| 2.4.2 细胞自噬促进SADS-CoV的复制 |
| 2.4.3 SADS-CoV感染诱导完整的自噬潮 |
| 2.4.4 SADS-CoV感染诱导内质网应激,并通过IRE1通路激活细胞自噬促进病毒的复制 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) |
| 1.1.2 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) |
| 1.1.3 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) |
| 1.2 猪腹泻病毒的诊断与防治 |
| 1.2.1 猪腹泻病毒的诊断 |
| 1.2.2 猪腹泻病毒的防治 |
| 1.3 共感染病原的相互作用与致病机制 |
| 1.3.1 PEDV、PDCoV、SAD-CoV共感染研究现状 |
| 1.3.2 病毒共感染的致病机制 |
| 1.3.3 冠状病毒的抗天然免疫研究进展 |
| 1.4 IPEC-J2细胞系 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 第二章 江西及周边地区PEDV、PDCoV、SADS-CoV三种主要猪肠道致病性病毒的流行病学调查及基于S1基因遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料与主要仪器和试剂 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 病毒核酸的提取 |
| 2.1.4 PEDV、PDCoV、SADS-CoV三种病毒的检测及S1 基因的扩增及测序 |
| 2.1.5 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的序列测定及分析 |
| 2.1.6 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因序列进化树构建和同源性分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PEDV、PDCoV、SAD-CoV三种腹泻病毒电泳结果 |
| 2.2.2 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和混合感染情况 |
| 2.2.3 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的扩增、克隆、测序结果 |
| 2.2.4 PEDVS1基因的进化树分析 |
| 2.2.5 PDCoV S1 基因进化树分析 |
| 2.2.6 SADS-CoV S1 基因的进化树分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 PEDV、PDCoV、SADS-CoV流行情况及共感染情况 |
| 2.3.2 PEDV、PDCoV、SADS-CoV S1 基因的遗传变异分析 |
| 第三章 PEDV、PDCoV与 SADS-CoV感染IPEC-J2 细胞的生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、载体与样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试剂和溶液的配制 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 SADS-CoV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1.7 细胞的复苏与培养 |
| 3.1.8 病毒的增殖与TCID50的测定 |
| 3.1.9 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的生长曲线 |
| 3.1.10 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的免疫荧光 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SADS-CoV S1 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 PEDV、PDCoV 和 SADS-CoV 单一/共感染 IPEC-J2 细胞的一步生长曲线 |
| 3.2.3 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2 细胞的免疫荧光 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV共感染IPEC-J2 细胞转录组分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 引物的设计与合成 |
| 4.1.5 PEDV、PDCoV和 SADS-CoV单一感染和混合感染实验及样品制备 |
| 4.1.6 细胞总RNA的提取、纯度和完整性分析 |
| 4.1.7 文库的构建与测序 |
| 4.1.8 转录组测序数据的处理与分析 |
| 4.1.9 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞总RNA纯度和完整性分析 |
| 4.2.2 转录组测序数据的处理与分析 |
| 4.2.3 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 细胞的免疫应答 |
| 4.3.2 细胞周期相关因子 |
| 4.3.3 胆固醇代谢 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 poly(I:C)抑制猪腹泻冠状病毒感染的机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞与病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 引物设计与合成 |
| 5.1.5 shRNA的设计与合成 |
| 5.1.6 干扰重组载体的构建 |
| 5.1.7 过表达重组载体的构建 |
| 5.1.8 poly(I:C)对病毒复制的影响 |
| 5.1.9 TLR3通路抑制剂对病毒复制的影响 |
| 5.1.10 TLR3 的激活和抑制对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响 |
| 5.1.11 统计学分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pCAGGS-TLR3和pcDNA3.1-U6-TLR重组载体的构建 |
| 5.2.2 pcDNA3.1-U6-TLR3和pCAGGS-TLR3 抑制和过表达效果验证 |
| 5.2.3 Poly(I:C)对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的抑制 |
| 5.2.4 Ploy(I:C)处理对TLR3 通路信号分子的表达情况 |
| 5.2.5 不同药物浓度Resveratrol、BX795 对细胞活度的测定 |
| 5.2.6 TLR3 的激活和抑制对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响 |
| 5.2.7 pcDNA3.1-U6-TLR3和p CAGGS-TLR3 对病毒的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PEDV、SADS-CoV和 PDCoV结构蛋白与INSIG1 相互作用机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 病毒、细胞与质粒 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 引物设计与合成 |
| 6.1.5 INSIG1 过表达和sh RNA的设计与合成 |
| 6.1.6 干扰重组载体的构建 |
| 6.1.7 过表达重组载体的构建 |
| 6.1.8 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染/共感染对胆固醇代谢的影响 |
| 6.1.9 NSIG1 过表达和sh RNA重组质粒效果鉴定 |
| 6.1.10 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒转染IPEC-J2 细胞对病毒复制的影响 |
| 6.1.11 PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组过表达质粒转染IPEC-J2 细胞 |
| 6.1.12 不同葡萄糖浓度对INSIG1的影响 |
| 6.1.13 统计学分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过表达载体的构建 |
| 6.2.2 INSIG1重组质粒的构建 |
| 6.2.3 PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染/共感染对胆固醇代谢的影响 |
| 6.2.4 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒效果鉴定 |
| 6.2.5 INSIG1 过表达和sh RNA重组质粒转染IPEC-J2 细胞对病毒复制的影响 |
| 6.2.6 PEDV、PDCoV、SADS-CoV结构和非机构基因对INSIG1 表达的影响 |
| 6.2.7 葡萄糖浓度对病毒影响INSIG1的关系 |
| 6.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 溶液、试剂配制及试剂盒操作步骤 |
| 附录 Ⅱ 附图与附表 |
| 攻读博士学位期间发表论文及获奖情况 |
| 致谢 |
四、SARS-CoVS2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]猪整合素αvβ1在PEDV感染过程中作用的初步研究[D]. 王一. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 韩郁茹. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]PEDVN蛋白通过p53-DREAM信号通路介导宿主细胞S期阻滞的分子机制[D]. 苏明俊. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [4]猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导宿主细胞凋亡的分子机制[D]. 张记宇. 中国农业科学院, 2021
- [5]携带sgRNA/ASFV p30-CRISPR/Cas9的rPRV的构建及初步鉴定[D]. 于海男. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究[D]. 刘建波. 中国农业科学院, 2020
- [7]猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究[D]. 张凡庆. 上海交通大学, 2020(01)
- [8]PEDV感染Vero E6细胞mRNA/miRNA表达谱分析及Abl2影响病毒复制机制研究[D]. 王潇博. 中国农业科学院, 2020(01)
- [9]猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬的机制研究[D]. 石达. 中国农业科学院, 2020(01)
- [10]PEDV、PDCoV与SADS-CoV共感染IPEC-J2细胞的转录组学及基于TLR3、INSIG1介导的信号通路抗病毒研究[D]. 张帆帆. 江西农业大学, 2020