一、慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义（论文文献综述）
周怡驰[1]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中研究指明中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
刘皎皎[2]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
张新奇[3]（2020）在《IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化》文中研究表明目的:肝纤维化（liver Fibrosis,LF）是肝脏对损伤刺激的异常修复过程,其特征表现为肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）的激活和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的沉积。白细胞介素（interleukin,IL）是一类作用十分广泛的细胞因子,其在信息传递,免疫细胞激活与调节,T和B淋巴细胞活化、增殖与分化及炎症反应中起着十分的重要作用。越来越多的证据表明,IL通过调节HSC细胞的活化参与了LF的病理过程,包括IL-1β、IL-6、IL-7及IL-9等。IL-26属于IL-10细胞因子超家族,与类风湿关节炎和炎症性肠病发生发展密切相关。然而,IL-26在LF中的生物学功能仍不清楚。本研究旨在检测IL-26对LF的影响,分析其对HSC细胞增殖和活化的作用及可能的分子机制。方法:构建HBV-Tg转基因小鼠模型,连续2周通过尾静脉每天注射0.25μg/g的人IL-26重组蛋白,饲养8-10个月后,获取肝脏组织,采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）和马松（Masson）染色观察肝脏组织的LF情况。采用ELISA实验检测小鼠肝脏组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6、IL-10、基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9,MMP-9）及α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达水平。体外分离并成功培养HSC细胞,采用饥饿疗法,将HSC细胞用无血清培养基培养24 h,随后分别给予0、50、100和200 pg/ml浓度的人IL-26重组蛋白刺激12 h,并采用细胞计数试剂盒（CCK-8）实验检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期情况,采用Annexin V-FITC/PI双重染色检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR分析HSC细胞中胱天蛋白酶3（caspase 3,CASP3）、Bcl2关联X蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）及信号传导蛋白Smad2（SMAD family member 2）m RNA的表达水平。采用蛋白质印迹分析HSC细胞中上述基因及磷酸化Smad2（p-Smad2）蛋白的表达水平。采用ELISA实验检测HSC细胞中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9及α-SMA蛋白的表达水平。统计学分析采用t检验或方差分析。结果:与对照组相比,尾静脉注射人IL-26重组蛋白促进HBV-Tg转基因小鼠LF,并显着增加肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9及α-SMA蛋白的表达水平（P<0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着增加HSC细胞的增殖（P<0.05）。IL-26刺激呈剂量依赖性导致HSC细胞中S期比例升高,而降低G0/G1期比例（P<0.05）。在不同浓度的IL-26刺激组中,HSC细胞中G2/M期比例没有显着差异（P>0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着降低HSC细胞的凋亡（P<0.05）。IL-26以剂量依赖性方式显着下调CASP3和BAX m RNA的表达水平（P<0.05）。给予不同浓度的IL-26刺激后,HSC细胞中CASP3、cleaved CASP3和BAX蛋白的表达水平呈剂量依赖性下降（P<0.05）。IL-26以剂量依赖的方式显着诱导HSC细胞的活化,其机制主要通过增加IL-6、IL-10、TNF-a、MMP-9和α-SMA的m RNA及蛋白表达水平（P<0.05）。此外,IL-26以剂量依赖性方式上调HSC细胞中TGF-β1、Smad2及p-Smad2蛋白的表达水平（P<0.05）。结论:尾静脉注射人IL-26重组蛋白促进HBV-Tg转基因小鼠LF,并显着增加肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-10、MMP-9和α-SMA蛋白的表达水平。IL-26以剂量依赖性方式增加HSC细胞的增殖和活化促进LF。IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化促进HBV-Tg转基因小鼠LF。该研究揭示了IL-26在LF中的重要作用,并将为LF的治疗提供新的思路及潜在靶点。
刘中兵[4]（2020）在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中研究说明第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组（不做处理）;IL-21组（50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 25μM组（50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 50μM组（50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS（活性氧）检测;各组MH7A细胞4-HNE（4-羟基壬烯醛）检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。（2）川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组（大鼠不做处理）;IL-21组（CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 25μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 50μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义（P<0.05）.形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。（2）与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
武喆[5]（2020）在《柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究》文中认为研究背景和目的乙型肝炎病毒（HBV）感染是严重的全球公共卫生问题,目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例,其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡,对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷（酸）类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA,难以实现CHB的临床治愈,新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶（RR）抑制剂,可以抑制细胞内核糖核苷酸（DNA）的生成,从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用,但其体内代谢过程仍不明确,生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定,并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析,进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。方法1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）鉴定柳胺酚在Sprague Dawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物,使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力,筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验,使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷（酸）类似物的联合用药指数。3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、Western Blot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。结果1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本,在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物（M1-M6）;在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物（M1、M2）;在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物（M1、M3和M6）;在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物（M1、M7-M10）。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYP1A2与CYP2C9参与了柳胺酚的Ⅰ相代谢反应;UGTIA1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性,可以显着降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量IC50 分别为 173.4μM、366.7μM、222.3μM 与 191.8μM,在 150μM 浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应;LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显着降低。Western Blot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclin D1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及Western Blot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显着抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显着抑制RR活性。结论1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7与UGT2B15是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力,其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显着降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性,具有良好的安全性。此外,LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷（酸）类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclin D1的表达水平,改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱,以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平,同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合,从而大幅抑制RR活性,发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
王海荣[6]（2020）在《母体孕晚期外周血细胞因子和TLR9在HBV宫内传播中的作用研究》文中研究说明研究背景目前在我国约9300万乙型肝炎病毒（HBV）携带者中[1],HBV母婴传播占50%[2],其中既往研究报道HBV宫内感染的发生率可达9.4%～44.4%[3]。当前有系列研究[4]对传统HBV宫内感染进行了拓展与修订,形成了新的HBV宫内传播定义,同时近年来研究提示HBs Ag阳性母亲所生子代乙肝疫苗免疫应答率仅为73.26%[5],故该部分人群更易发生HBV母婴传播。如何早期筛检和预警HBV母婴传播的高危人群是目前研究的空白领域。由于HBV感染机体可以诱导Thl/Th2细胞不平衡免疫应答是HBV感染慢性化的主要原因,TLR是目前病毒免疫中的热点,因此,本研究在HBV宫内传播的新内涵基础上,采用巢式病例对照和队列研究方法,通过描述HBs Ag阳性孕妇妊娠晚期外周血中Thl/Th2细胞因子和TLR 9的水平,筛选出子代HBV宫内传播和乙肝疫苗免疫无应答的早期血清学预警指标,为HBV宫内传播的预防与控制奠定理论基础。研究目的1、获取HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血Th1/Th2细胞因子水平的表达特征,筛选与子代发生HBV宫内传播相关的Th1/Th2细胞因子。2、获取HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血TLR 9水平的表达特征,掌握其对子代发生HBV宫内传播的作用。3、基于随访HBs Ag阳性孕产妇所生幼儿在完成乙肝疫苗全程计划免疫接种后HBV感染状态及乙肝疫苗免疫应答情况,获取母体孕晚期细胞因子和TLR 9水平与其幼儿HBV感染和乙肝疫苗免疫应答情况的关联性。研究对象与方法1、研究对象（1）Th1/Th2细胞因子的巢式病例对照研究:采集陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的341例HBs Ag阳性孕产妇和344例新生儿（双胎3例）及74例健康孕产妇和新生儿孕晚期外周血及其流行病学调查信息。以24小时内子代外周血（未注射乙肝高效价免疫球蛋白,未接种乙肝疫苗及卡介苗）HBs Ag阳性者为发生HBV宫内显性感染;HBs Ag阴性而HBV-DNA定量≥200IU/ml为发生HBV宫内隐匿性感染。二者合称为发生HBV宫内传播[5]。（2）TLR 9的巢式病例对照研究:采集陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的290例HBs Ag阳性孕产妇和新生儿291例（双胎1例）及45例健康孕产妇及新生儿孕晚期外周血及其流行病学调查信息。（3）队列研究:以陕西省西北妇女儿童医院住院分娩的HBs Ag阳性孕产妇及幼儿在本院完成乙肝疫苗全程计划免疫接种、签署知情同意者91例,通过调查问卷随访并成功采集其外周血,最终纳入随访队列幼儿为83例。2、流行病学调查（1）流行病学基线调查:孕产妇孕产期的一般情况和新生儿一般情况;（2）流行病学随访调查:新生儿喂养情况和疫苗接种情况。3、实验室检测（1）采集孕产妇孕晚期外周血和新生儿外周血,采用ELISA法检测血清乙型肝炎5项指标;（2）采用实时荧光定量PCR检测孕产妇及新生儿血清中HBV-DNA水平;（3）采用流式液相芯片法检测孕产妇血清中Th1/Th2细胞因子水平,其中Th1细胞因子包括:IL-2、IL-12、IL-18、INF-γ,Th2细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10;（4）采用ELISA法检测孕产妇血清中TLR 9水平。4、数据统计分析方法采用Epi Data建立数据库,数据运用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验,两组比较方差齐者采用t检验,方差不齐者采用Mann-Whitney U检验;多组比较方差齐者采用方差分析,方差不齐者采用非参Kruskai-Wallis检验;计数资料采用χ2检验。单因素与多因素采用Logistic回归分析。诊断效能采用ROC曲线下面积,所有的检验显着性标准均设置为0.05。研究结果一、母体孕晚期Th1细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究1、研究人群发生HBV宫内显性感染率（DBI）、HBV宫内隐匿性感染率（OBI）、HBV宫内传播率（BIT）、HBV宫内未传播率（NBIT）分别为11.34%（39/344）、36.63%（126/344）、47.97%（165/344）、52.03%（179/344）。2、HBs Ag阳性孕产妇及各宫内传播分组外周血中Th1细胞因子水平的研究（1）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IL-2水平与HBs Ag阴性对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。（2）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IFN-γ水平均显着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001;P<0.0001;P=0.021;P<0.0001）。（3）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、NBIT组、OBI组外周血的IL-12水平均显着低HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001;P=0.002;P<0.0001）,其中NBIT组IL-12水平显着高于OBI组（P=0.047）。（4）HBs Ag阳性孕产妇及其BIT组、OBI组外周血的IL-18组水平显着高于HBs Ag阴性对照组（P=0.022;P=0.014;P=0.007）。3、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下Th1细胞因子水平状况（1）HBe Ag阳性组IFN-γ、IL-18水平均显着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001;P<0.0001）,但是HBe Ag阳性组孕产妇的IL-12水平显着低于HBs Ag阴性对照组（P=0.015）。（2）按103IU/ml、106IU/ml为截点分3个层次,母体HBV-DNA载量103～106IU/ml组中IL-18水平增加,子代发生DBI的风险增加（P=0.045）。4、HBs Ag阳性孕产妇孕期干预情况与Th1细胞因子水平的关系（1）注射乙肝免疫球蛋白组中,DBI组母体IFN-γ水平显着低于NBIT组（P=0.008）,OBI组母体IL-12水平显着低于NBIT组（P=0.008）;在NBIT组中注射乙肝免疫球蛋白母体IFN-γ水平显着高于未注射乙肝免疫球蛋白组（P=0.006）;注射乙肝免疫球蛋白组其体内IL-18水平显着高于未注射组（P=0.040）。（2）抗病毒治疗组和注射乙肝疫苗组IFN-γ水平呈现组内分化现象,OBI组母体IFN-γ水平显着低于NBIT组（P=0.027,P=0.029）;在未注射乙肝疫苗组和注射乙肝免疫球蛋白组中OBI组母体的IL-18水平均显着高于NBIT组（P=0.047,P=0.036）。5、Th1细胞因子与HBV宫内传播做单因素分析,未筛选出显着相关因素。6、Th1细胞因子和多种变量因素与HBV宫内传播做多因素Logistic回归分析,未筛选出显着相关因素。二、母体孕晚期Th2细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究1、Th2细胞因子中,HBs Ag阳性孕产妇及其NBIT组、DBI组、OBI组外周血的IL-4、IL-6、IL-10水平均显着高于HBs Ag阴性者对照组（P<0.05）。2、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下Th2细胞因子水平状况（1）HBe Ag阴性组孕产妇和HBe Ag阳性组孕产妇IL-4、IL-6、IL-10水平显均着高于HBs Ag阴性对照组（P<0.05）;（2）母体HBV-DNA含量<103IU/ml组中,DBI组母体IL-4水平显着高于OBI组（P=0.011）和NBIT组（P=0.007）;HBV-DNA>106IU/ml组中,OBI组母体IL-10水平显着低于NBIT组（P=0.031）;DBI组母体IL-4水平在HBV-DNA>106IU/ml组者显着低于HBV-DNA<103IU/ml组（P=0.016）。3、在未抗病毒治疗组和未注射乙肝疫苗组中,OBI组母体IL-6水平均显着高于DBI组（P=0.008;P=0.012）。4、单因素分析发现,IL-4与HBV宫内传播显着相关,IL-4高水平者其子代发生BIT的概率是NBIT的1.003倍（OR=1.003,95%CI:1.000-1.006,P=0.046）。5、多因素分析发现,随着孕产妇外周血IL-4水平增加,DBI风险增加。孕产妇IL-4高水平者其子代发生DBI的概率是发生NBIT的1.005倍（OR=1.005,95%CI:1.001-1.010,P=0.025）。三、母体孕晚期TLR 9在子代HBV宫内传播中的作用研究1、研究人群发生DBI、OBI和BIT率分别为9.28%（27/291）、40.21%（117/291）和49.48%（144/291）。2、HBs Ag阳性孕产妇及其NBIT组、OBI组外周血的TLR 9水平显着低于HBs Ag阴性者对照组（P<0.0001;P<0.0001;P<0.0001）,其中NBIT组TLR 9水平显着低于BIT组（P=0.015）,DBI组的TLR 9水平显着高于NBIT组和OBI组（P=0.001;P<0.0001）。3、HBs Ag阳性孕产妇不同HBV感染状态下TLR 9水平状况（1）HBe Ag阴性组孕产妇的TLR 9水平显着低于HBs Ag阴性对照组（P<0.0001）;按BIT程度由重至轻分为:DBI组、OBI组和NBIT组,均随着BIT程度的加重,孕产妇TLR 9含量呈增加趋势（P<0.05）;无论HBe Ag阴性和阳性组,DBI组TLR 9水平均显着高于OBI组和NBIT组（P<0.01）;（2）按103IU/ml、106IU/ml为截点分3个层次,每层均随BIT程度的加重,TLR 9水平呈增加趋势（P<0.05）,每层中DBI组TLR 9水平均显着高于OBI组和NBIT组（P<0.05）。4、无论抗病毒治疗与否,注射乙肝免疫球蛋白与否和未注射乙肝疫苗组,均随着BIT程度的加重,孕产妇外周血TLR 9含量呈增加趋势,孕产妇外周血TLR 9含量DBI组显着高于OBI组和NBIT组（P<0.0001;P<0.0001）。5、单因素分析发现,孕产妇外周血TLR 9水平增加,发生DBI的风险增加。孕产妇TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是NBIT的1.39倍（OR=1.392,95%CI:1.224-1.582,P<0.0001）,发生DBI的概率是OBI的1.36倍（OR=1.360,95%CI:1.195-1.549,P<0.0001）。6、多因素分析发现:（1）孕产妇外周血TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是NBIT的1.44倍（OR=1.442,95%CI:1.247-1.667,P=0.000）。HBV-DNA载量在103～106 IU/ml组中,发生DBI的概率是NBIT的0.14倍（OR=0.135,95%CI:0.023-0.781,P=0.025）。（2）TLR 9表达高水平者其子代发生DBI的概率是OBI的1.43倍（OR=1.434,95%CI:1.237-1.663）。乙肝免疫球蛋白未注射组中,子代发生DBI的概率是OBI的0.13倍（OR=0.131,95%CI:0.043-0.399）。四、母体孕晚期细胞因子及TLR 9表达与其幼儿预后的队列研究1、本次调查共随访到83例幼儿及其母亲,随访幼儿中发生HBV隐匿性感染27例（32.53%）,未感染56例（67.47%）。总体幼儿乙肝免疫应答率为72.29%;DBI组、OBI组和NBIT组乙肝疫苗应答率分别为81.82%（9/11）、80.00%（28/35）、62.16%（23/37）;随访幼儿隐匿性感染组和未感染组中发生乙肝疫苗免疫应答率为88.89%（24/27）、64.29%（36/56）。2、母体孕晚期外周血IL-2高水平者其幼儿转归中HBV感染的风险呈降低趋势（P=0.014）。3、随访幼儿乙肝疫苗无免疫应答组其母亲孕晚期IL-2水平显着高于抗体阳性组幼儿组（P=0.013）。4、将本研究中检测的Th1/Th2细胞因子与TLR 9纳入HBV宫内传播进行ROC曲线分析,结果显示TLR 9灵敏度为43.90%,特异度为76.20%,约登指数为0.201。曲线下面积为0.582（95%CI:0.516-0.649）,TLR 9的临界值为1.690pg/ml。因此当TLR9高于此临界值时,提示可能已发生HBV宫内传播。5、将本研究中检测的Th1/Th2细胞因子及TLR 9纳入幼儿HBV感染进行ROC曲线分析,结果显示IL-2灵敏度为92.30%,特异度为52.40%,约登指数为0.447。曲线下面积为0.755（95%CI:0.592-0.917）,IL-2的临界值为2.275pg/ml。因此当孕晚期母体低于此临界值时,随访幼儿发生HBV感染的风险增加。6、将Th1/Th2细胞因子及TLR 9水平与幼儿HBV免疫应答进行ROC曲线分析,结果发现IL-2灵敏度为80.90%,特异度为61.10%,约登指数为0.420。曲线下面积为0.677（95%CI:0.521-0.833）,IL-2的临界值为2.490pg/ml。因此当孕期母体低于此临界值时,其随访幼儿产生乙肝疫苗免疫应答的能力降低。结论基于HBV宫内传播的新内涵,通过巢式病例对照研究和队列研究筛选出HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血的IL-12、IL-18、IL-4、TLR 9可以作为早期预测HBV宫内传播发生的监测指标,HBs Ag阳性孕产妇孕晚期外周血的IL-2可作为预测子代发生HBV感染和乙肝疫苗免疫无应答的参考指标。1、HBs Ag阳性孕产妇机体内IL-12、IL-18水平降低,而IL-4、TLR 9高表达者发生HBV宫内传播的可能性增加,可一定程度上作为HBV宫内传播预警指标的细胞因子。一定程度上IL-10水平减少易于发生HBV宫内传播,可作为预测HBV宫内传播有效的参考指标。2、注射乙肝免疫球蛋白可以刺激母体IFN-γ、IL-12及IL-18水平增加,及时纠正HBV引起的免疫紊乱,降低发生HBV宫内传播的几率,为HBV宫内阻断提供了有效干预指标。3、HBV会抑制孕产妇体内TLR 9的表达,但随着HBV感染病情的加重,TLR 9呈现代偿性上调,呈现组内分化现象,TLR 9可为HBs Ag阳性孕产妇监测管理提供参考。4、妊娠晚期孕产妇的IL-2水平可以预测幼儿转归过程中发生HBV感染的风险,孕产妇IL-2分泌能力可能参与幼儿HBs Ab产生的应答。5、孕晚期母体内TLR 9水平高于1.690pg/ml时,提示可能已发生HBV宫内传播;母体孕晚期IL-2水平低于2.275pg/ml时,随访幼儿中发生HBV感染的风险增加;其IL-2水平低于2.490pg/ml时,幼儿产生乙肝疫苗免疫应答的能力降低。
赵倩[7]（2020）在《长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究》文中研究表明第一部分:长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究研究背景肝癌由于每年约84万新确诊病例和74万死亡病例成为肿瘤致死的主要元凶之一,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占 85%-90%。肝癌的病因多种,包括酗酒,黄曲霉毒素污染饮食,肝炎病毒感染等。根据全球癌症研究署报告,引起肝癌的病因分布具有地域性差异,在我国HCC主要与慢性乙型肝炎病毒感染引起的慢性乙型肝炎有关。在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染过程中,肝细胞长期受到炎症刺激可出现肝硬化（Liver cirrhosis,LC）和HCC,被称为慢性HBV感染“三部曲”。HCC起病隐匿,恶性程度高,进展迅速,预后极差。近年来,针对HCC的治疗方法发展迅速,包括全身化疗,射频消融,微波消融,但是HCC晚期患者预后仍不理想。根据以往的研究报道,HCC的发生发展是一个极其复杂的过程,可涉及到多种基因以及信号通路异常。因此,研究HCC发生发展的分子机制,寻找和探索治疗HCC新靶点显得尤为重要。长非编码 RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是长度大于 200nt,不具有蛋白质编码功能的RNA。大量实验研究表明LncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用,可以影响肿瘤进展中的许多生物学功能,包括上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）、侵袭、转移、增殖、凋亡和药物抗性。有研究报道 lncRNA-小核仁 RNA 宿主基因 3（Small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3）可参与恶性肿瘤发生发展过程中。SNHG3在多种恶性肿瘤内表达异常并且与疾病进展相关,比如结直肠癌、肺腺癌和神经胶质瘤。SNHG3表达异常还与恶性肿瘤预后相关,比如SNHG3在卵巢癌中表达增加常预示卵巢癌预后不良。SNHG3在HCC中表达升高并且在HCC进展过程中发挥作用,但是SNHG3在HCC中确切的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究SNHG3的作用机制判断SNHG3是否可以作为新的治疗靶点十分重要。MicroRNA（miRNA）属于高度保守的小非编码RNA,其在恶性肿瘤中的生物学作用得到广泛认可,包括细胞增殖,侵袭,凋亡,代谢和信号转导。据报道,miRNA-326（miR-326）参与细胞凋亡、侵袭,胚胎发育,肿瘤生长,免疫调节,化疗药物抗药性和肿瘤发生。MiR-326在神经胶质瘤,子宫内膜癌和宫颈癌中通过靶向不同的mRNA起到肿瘤抑制剂的作用。MiR-326在HCC中低表达,并且可以促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和肿瘤生长。研究报道许多lncRNA作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNAs,ceRNA）可以通过 microRNA 反应元件（microRNA response element,MRE）竞争性地结合miRNA,从而降低miRNA对靶mRNA的抑制作用。即miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默,而lncRNA可以作为ceRNA与mRNA竞争结合miRNA,从而抑制miRNA导致的基因沉默。然而,目前SNHG3和miR-326在HCC中的关系还没有研究报道。研究目的1.明确SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确SNHG3在肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达规律,分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3表达水平与临床病理参数之间的相关性。3.寻找SNHG3可以结合的miRNA。4.明确SNHG3作为miR-326的ceRNA发挥生物学功能。5.明确SNHG3对于miR-326的靶mRNASMAD3的调控。6.明确SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学功能。研究方法1.检测SNHG3在患者外周血单个核细胞中的表达情况本研究自2016年5月至2017年12月期间,在山东大学齐鲁医院肝病科住院病人中收集了 124例患者外周静脉血,其中30例慢性乙型肝炎患者、30例肝硬化患者、40例肝细胞肝癌患者以及24例健康志愿者作为对照。通过提取研究对象的外周血单个核细胞,利用qRT-PCR检测外周血单个核细胞中SNHG3表达水平。2.检测SNHG3在HCC组织标本和肝癌细胞系中的表达情况在2017年8月到2018年1月期间,我们在山东大学齐鲁医院手术患者中收集47对HCC患者肿瘤组织和癌旁对照组织。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中SNHG3表达水平,再利用统计学方法分析肿瘤组织中SNHG3表达水平与患者临床病理参数的相关性。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中SNHG3表达水平。3.寻找SNHG3相结合的miRNA及其检测其表达水平生物信息学软件预测可能与SNHG3结合的miRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测SNHG3与miR-326可以相互结合。利用qRT-PCR检测47对肝细胞肝癌肿瘤组织标本和癌旁对照组织标本中miR-326表达水平。利用Pearson correlation分析肝细胞肝癌组织标本中SNHG3与miR-326表达水平之间的关系。利用qRT-PCR检测正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中miR-326表达水平。4.检测SNHG3作为miR-326的ceRNA对细胞生物学功能的影响在肝癌细胞中分别转染小干扰RNA si-SNHG3,共转染si-SNHG3和miR-326 mimic、感染慢病毒 pLVX-SNHG3、共转染 pLVX-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用MTT、Transwell、流式细胞术、qRT-PCR和western blot分别检测干扰和过表达SNHG3对细胞增殖、迁移、凋亡和EMT的影响以及检测miR-326过表达和低表达对SNHG3细胞生物学功能的影响。5.检测 SNHG3 对 miR-326 靶 mRNA SMAD3 的调控5.1 检测 miR-326 的靶 mRNA利用生物信息学软件预测miR-326的靶mRNA,利用双荧光素酶基因报告实验检测miR-326是否对SMAD3具有调节作用;利用qRT-PCR和western blot检测SMAD3在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平,以及在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平;在肝癌细胞中分别转染miR-326 mimic和miR-326 inhibitor,利用qRT-PCR和western blot检测过表达或者干扰miR-326对SMAD3 mRNA和蛋白表达水平的影响。5.2检测SNHG3通过吸附miR-326调控SMAD3在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒、共转染pLVX-SNHG3和miR-326 mimic、转染 si-SNHG3 和共转染 si-SNHG3 和 miR-326 inhibitor,利用 qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3表达水平的影响以及SNHG3和miR-326相互结合后对SMAD3表达水平的影响6.检测SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥生物学作用6.1检测ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达情况利用qRT-PCR检测ZEB1在47对肝细胞肝癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的表达水平;利用qRT-PCR和western blot检测ZEB1在正常肝细胞L02、肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平。6.2检测SNHG3调控ZEB1表达在肝癌细胞中转染pLVX-SNHG3或者转染si-SNHG3,利用qRT-PCR和western blot检测过表达和干扰SNHG3对SMAD3下游基因ZEB1 mRNA和蛋白表达水平的影响。6.3检测SNHG3通过ZEB1发挥生物学功能在肝癌细胞中感染pLVX-SNHG3慢病毒,共转染pLVX-SNHG3和si-ZEB1、转染si-SNHG3、共转染si-SNHG3和pLVX-ZEB1,利用MTT检测干扰和过表达ZEB1是否影响SNHG3对细胞增殖的作用,利用western blot检测干扰ZEB1是否影响SNHG3对细胞EMT的作用。6.4体内实验检测SNHG3作为miR-326的ceRNA可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1信号通路发挥作用构建SNHG3干扰的肝癌细胞进行裸鼠皮下种植瘤实验,测量皮下种植瘤的大小,33天后解剖小鼠,观察裸鼠皮下种植瘤的生长状态。对小鼠皮下原位种植瘤组织切片进行Ki-67染色和Tunel染色,检测在体内干扰SNHG3对于细胞增殖和凋亡的影响,利用western blot检测SNHG3在体内对EMT的影响以及对于SMAD3和ZEB1蛋白表达水平的影响。研究结果1.SNHG3在研究对象外周血单个核细胞中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞中的表达水平显着高于慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组。SNHG3在慢性乙型肝炎、肝硬化和健康对照组外周血单个核细胞中的表达水平无明显差异。2.SNHG3在HCC组织标本中和肝癌细胞系中的表达情况SNHG3在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁对照组织,卡方检验显示SNHG3的表达水平与TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关,与年龄、性别无明显相关性。SNHG3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。3.SNHG3可以与miR-326相互结合及其miR-326的表达水平通过生物信息软件分析有16个miRNAs具有与SNHG3相互结合的序列,经查阅Pubmed发现miR-326在肝细胞肝癌中低表达并且和预后相关;双荧光素酶基因报告实验显示miR-326 mimic抑制SNHG3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SNHG3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响。MiR-326在肝细胞肝癌组织中表达水平明显高于癌旁对照组织,Pearson correlation分析在肝细胞肝癌组织中SNHG3与miR-326表达水平呈负相关。MiR-326在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞L02。4.SNHG3作为miR-326的ceRNA促进细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡干扰SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力降低但是细胞凋亡能力升高,miR-326 inhibitor（anti-326）抑制SNHG3低表达产生的上述细胞生物学功能;过表达SNHG3肝癌细胞增殖、迁移、EMT能力升高但是细胞凋亡数量降低,miR-326 mimic抑制SNHG3过表达产生的上述细胞生物学功能。5.SNHG3 调控 miR-326 的靶 mRNA SMAD3 的表达5.1 miR-326 抑制靶 mRNA SMAD3 的表达生物信息学软件分析SMAD3是具有与miR-326具有相互结合序列的mRNA,双荧光素酶基因报告实验证实miR-326 mimic抑制SMAD3-WT载体的荧光素酶活性,但是对SMAD3-MUT的荧光素酶活性没有明显影响;QRT-PCR结果显示SMAD3在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织;QRT-PCR和western blot结果显示SAMD3在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02;QRT-PCR和western blot结果显示miR-326过表达则SMAD3 mRNA和蛋白的表达降低,抑制miR-326则SMAD3 mRNA和蛋白的表达升高。5.2 SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达SNHG3过表达则SMAD3表达升高,共转染miR-326mimic则SMAD3表达下降;干扰SNHG3则SMAD3表达降低,共转染miR-326 inhibitor则SMAD3表达升高。6.SNHG3通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能6.1 ZEB1在组织标本和肝癌细胞系中的表达ZEB1在47例肝细胞癌肿瘤组织标本的表达水平明显高于癌旁对照组织,在肝癌细胞系HepG2细胞和HCCLM3细胞中的表达水平明显高于正常肝细胞L02。6.2 SNHG3促进ZEB1表达干扰SNHG3可以降低ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平,过表达SNHG3可以升高ZEB1 mRNA和蛋白的表达水平。6.3 SNHG3通过ZEB1促进细胞增殖和EMT过表达SNHG3肝癌细胞增殖能力和EMT能力增加,同时干扰ZEB1则抑制SNHG3过表达导致的细胞增殖能力和EMT改变;干扰SNHG3则肝癌细胞增殖能力和EMT能力降低,同时过表达ZEB1则抑制SNHG3低表达导致的细胞增殖能力和EMT改变。6.4体内实验证实SNHG3可能通过SMAD3及其下游基因ZEB1发挥生物学功能干扰SNHG3可以抑制裸鼠皮下原位种植瘤的生长。对裸鼠皮下原位种植瘤组织切片染色,Ki-67染色程度明显降低,Tunel染色程度明显升高,western blot结果显示细胞EMT降低。此外,干扰SNHG3则SMAD3和ZEB1在蛋白水平的表达降低。研究结论在本实验中,我们发现SNHG3的表达水平在HCC患者外周血单核细胞、肝细胞肝癌组织和肝癌细胞系中明显升高,并且与患者TNM分期、有无淋巴结转移和远处转移相关。SNHG3具有与miR-326结合位点并且可以相互结合,此外SNHG3与miR-326的表达水平呈现负相关。SNHG3作为miR-326的ceRNA可以促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡,miR-326抑制SNHG3的上述细胞生物学功能。MiR-326抑制靶mRNA SMAD3的表达,SNHG3通过吸附miR-326促进SMAD3表达。SNHG3通过调节SMAD3的下游基因ZEB1的表达进一步影响肝癌细胞的生物学效应。总之,SNHG3作为miR-326的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）促进 SMAD3 及其下游基因 ZEB1的表达,进而促进肝癌细胞增殖、迁移、EMT和抑制凋亡。第二部分:长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭（Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF）是在慢性乙型肝炎进展过程中,由于某些急性损伤导致部分患者在短时间内出现肝功能迅速恶化,以黄疸,凝血障碍为主要临床表现,并在四周内出现腹水和/或肝性脑病等症状。ACHBLF可以发生在慢性HBV感染的任何阶段,进展迅速,由于缺乏有效的临床治疗方法ACHBLF死亡率高达50%-90%。目前,国际上约有20多种关于评估肝衰竭预后的方法,其中终末期肝病积分（Model for end-stage liver disease,MELD）是最常用的关于肝衰竭预后的评估方法,由于导致肝衰竭的因素差异,MELD对于ACHBLF预后的评估不甚理想。因此,寻找更加有效的ACHBLF预后评估方法具有重要意义。慢加急性乙型肝炎肝衰竭在不同时相经历三重打击,包括免疫损伤,缺血缺氧性损伤和内毒素血症。在肝衰竭的发生过程中,炎症因子介导的免疫损伤起了重要作用。细胞因子失衡作为已知的ACHBLF病理机制越来越得到大家的重视,由于HBV感染和细胞毒效应介导的免疫紊乱,通过细胞因子失衡进一步促进ACHBLF的进展。此外,在肝衰竭发展过程中会出现肾上腺功能不全,因此早期利用糖皮质激素成为治疗早期慢加急性乙型肝炎肝衰竭的方法之一。糖皮质激素可以通过保护细胞膜,溶酶体酶和线粒体来防止肝细胞坏死和进行性急性恶化。糖皮质激素是一把双刃剑,正确应用可以极大提高患者的生存率。然而,在ACHBLF患者中使用糖皮质激素是否对细胞因子失衡产生影响尚且没有研究。在之前的研究中我们证实了 lncRNA SNHG3与miR-326在肝细胞肝癌中可以通过SMAD3信号通路促进肝细胞肝癌进展,然而miR-326还可以作为关键的促炎因子通过核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路参与多种炎症过程。NF-κB作为重要的转录因子可以调节NLRP3的表达。NLRP3（Nucleotide-binding oligomerisation domain-like receptors（NLRs）Family Pyrin Domain Containing 3）属于NLRs蛋白家族,被激活后通过活化caspase-1使细胞因子白介素1β前体（pro-interleukin（IL）-1β,pro-IL-1β）和白介素18前体（pro-interleukin（IL）-18,pro-IL-18）变为有活性的 IL-1β 和 IL-18。IL-1β 和 IL-18作为重要的促炎性分子,其表达紊乱可以导致细胞因子失衡。目前lncRNA SNHG3与miR-326在ACHBLF中的表达状态以及NLRP3与ACHBLF之间的关系尚不清楚。因此本研究首先检测SNHG3和miR-326在ACHBLF患者中的表达水平,再检测促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3的表达状态,接着分析糖皮质激素对于促炎性细胞因子IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响以及与预后的关系。研究目的1.明确 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者和健康对照者（healthy controls,HCs）外周血单个核细胞中的表达规律。2.明确促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中的表达规律。3.明确NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs表达规律及与ACHBLF患者临床数据的相关性。4.研究糖皮质激素对于IL-1β和IL-18和NLRP3表达的影响。研究方法1.利用 qRT-PCR 检测 SNHG3 和 miR-326 在 ACHBLF 患者、CHB 患者和 HCs外周血单个核细胞中的表达规律。2.利用ELISA和qRT-PCR检测ACHBLF患者、CHB患者和HCs血浆和外周血单个核细胞中促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达情况。3.利用qRT-PCR检测NLRP3在ACHBLF患者、CHB患者和HCs外周血单个核细胞中的表达规律,利用Spearman线性相关分析NLRP3 mRNA水平与相关临床指标之间的关系。4.对接受28天糖皮质激素治疗的ACHBLF患者进行3个月随访,根据患者的生存状况分为生存组和死亡组。通过qRT-PCR检测两组患者外周血单个核细胞中NLRP3及其相关因子在接受糖皮质激素治疗过程中第7天和第28天的表达情况。研究结果1.SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显低于CHB患者和HCs;miR-326在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB和HCs患者。即在ACHBLF中,SNHG3表达降低对于miR-326的吸附作用下降。2.促炎性细胞因子IL-1β和IL-18在ACHBLF患者血浆和外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB患者和HCs。3.NLRP3 mRNA在ACHBLF患者外周血单个核细胞中的表达水平明显高于CHB 患者和 HCs,并且与总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、MELD 评分（model for end-stage liver disease）呈正相关,与凝血酶原活动度（prothrombin activity,PTA）、白蛋白（Albumin,ALB）呈负相关,与谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、肌酐（Creatinine,Cr）无明显相关性。4.在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显低于死亡组。在接受糖皮质激素治疗的第7天和第28天,生存组TBIL和PTA也明显低于死亡组。此外,ACHBLF患者生存组外周血单个核细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在接受糖皮质激素治疗过程中表达水平呈持续性下降,死亡组则无明显改变甚至有升高的表达趋势。研究结论LncRNA SNHG3在ACHBLF患者外周血单个核细胞中表达下降,而其可以结合的miR-326则表达升高。在ACHBLF中miR-326可能通过NF-κB信号通路使NLRP3及其对应的促炎性细胞因子表达升高并且与患者的临床严重程度呈正相关。此外,糖皮质激素通过调节NLRP3表达水平影响ACHBLF预后。
马宁[8]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中提出第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
魏艳艳[9]（2019）在《TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究》文中研究说明乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起,危及全球人类健康的传染病。在HBV感染过程中,适应性免疫应答在肝脏损害及病毒清除中发挥重要作用。研究表明,急性HBV感染时,激活外周血CD4+辅助性T细胞及CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocyte response,CTL）反应能够有效清除病毒。慢性HBV感染时,抑制性受体在病毒特异性CD8+T细胞表达逐渐增多,参与了CD8+T细胞耗竭,使其无法发挥有效清除病毒作用,导致病毒持续存在和肝损伤。阻断抑制性受体通路可逆转T细胞耗竭,增强T细胞免疫,从而增强病毒清除能力。T细胞免疫球蛋白域和免疫受体酪氨酸抑制基序（T cell immunoglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT）是在基因组研究中发现的共抑制受体,主要表达于T细胞、自然杀伤性细胞（Natural killer,NK）和调节性T细胞（Regulated T cell,Treg）等细胞表面。在病毒感染免疫方面,TIGIT在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）等感染的T细胞免疫中作为共抑制受体起关键作用。TIGIT作为抑制性受体在乙肝病毒感染中作用的相关研究少。近期有研究报道,在HBs Ag阳性小鼠中,TIGIT作用于肝脏HBV特异性CTL导致细胞免疫耐受,HBV难以清除,阻断TIGIT通路或抑制TIGIT表达可使HBV特异性CTL功能恢复,导致肝脏炎症激活和乙肝病毒清除。程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1,PD-1）也是参与T细胞耗竭的一个关键负调控分子。TIGIT作为抑制性受体在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能及其与PD-1是否有协同作用尚无相关报道。本研究主要探讨TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能,并揭示TIGIT与PD-1在慢性HBV感染者T细胞功能耗竭中的协同作用。本研究分为以下三个部分:第一部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达的研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞、T细胞分化亚群和HBV特异性CTL上的表达及其与PD-1表达的关系。方法:收集和分离73例慢性HBV感染者和28例健康志愿者（healthy donors,HD）血浆和外周血单个核细胞（PBMC）并冻存。采用流式细胞术检测:（1）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞表达;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞不同分化阶段的表达;（3）采用人白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-A*0201/FLPSDFFPSV（HBVcore18-27）和HLA-A*0201/NLVPMVATV（cytomegalovirus 65 k Da Phosphoprotein,CMVpp65）五聚体（pentamer,PENTA）检测HBV和CMV特异性CTL,随后检测TIGIT和PD-1在HBV及对照CMVpp65特异性CTL表达。结果:（1）与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达明显升高（12.28±0.93%vs.7.98±0.86%,P=0.0083;30.77±2.00%vs.16.61±2.17%,P=0.0001）;（2）与乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBe Ag）阴性组相比,TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者组CD4+和CD8+T细胞表达明显升高（13.79±1.31%vs.10.19±1.17%,P=0.0130;32.94±2.84%vs.27.75±2.64%,P=0.0043）;（3）与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者各T细胞分化亚群表达均上调（P值均<0.05）;且TIGIT在慢性HBV感染者CD28-CD45RA+CD4+和CD28-CD45RA+CD8+T细胞表达最高（P<0.01,P<0.001）;（4）TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上的表达和PD-1的表达呈正相关。TIGIT和PD-1在CD4+T细胞及CD8+T细胞表面均存在双阳性表达;（5）与CMVpp65特异性CTL相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高（P<0.0001,P=0.0003）;（6）与PENTA-CD8+T细胞相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高（P<0.0001,P<0.0001）;（7）TIGIT和PD-1在HBVcore18-27特异性CTL上双阳性表达所占百分比与TIGIT单阳性及PD-1单阳性表达所占百分比相比有差异（P<0.001）,以双阳性表达所占百分比最高。结论:（1）TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达均上调,在效应性T细胞亚群的表达最高;TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者PBMC中的T细胞表达高于HBe Ag阴性者;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上存在共表达状态;（3）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBV特异性CTL高表达,且以TIGIT和PD-1共表达状态为主。第二部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞中的功能研究目的:研究TIGIT对慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌、细胞增殖及凋亡敏感性的影响及TIGIT和PD-1的协同作用。方法:收集和分离85例慢性HBV感染者血浆和PBMC并冻存。采用流式细胞仪检测:（1）用佛波酯/离子霉素（phorbol 12-myristate-13-acetate/ionomycin,PMA/ionomycin）刺激,表面染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群表达CD69;采用胞内染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群分泌颗粒酶B（Granzyme B,Gr B）和穿孔素（Perforin）;（2）用HBVcore18-27肽段刺激,检测:（1）TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群表达CD69,TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群分泌Gr B、Perforin、干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）、白介素-2（Interleukin-2,IL-2）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）;（2）采用羟基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺脂（carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）实验检测细胞增殖;（3）TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞在未处理组、活化诱导凋亡（activation induced cell death,AICD）组和阻断TIGIT通路组凋亡比例;（4）用PMA/Ionomycin刺激,检测TIGIT+PD-1+和TIGIT-PD-1-CD8+T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α;（5）阻断TIGIT和/或PD-1通路,用HBVcore18-27肽段刺激,检测HBV特异性CTL分泌IFN-γ和IL-2。结果:（1）与TIGIT-CD8+T细胞群相比,TIGIT+CD8+T细胞群表面活化标记CD69表达明显升高（P=0.0095）,TIGIT+CD8+T细胞群中分泌Gr B和Perforin的细胞所占百分比明显下降（P=0.0205,P=0.0377）;（2）与TIGIT阴性HBV特异性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群表达CD69明显升高（P=0.0014）,TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌Perforin和Gr B的细胞所占百分比明显下降（P=0.0360,P=0.0205）;（3）与TIGIT阴性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞所占百分比均下调（P=0.0407,P=0.0446,P=0.0087）,细胞增殖降低（P=0.0029）;阻断TIGIT通路并用HBVcore18-27肽段刺激,HBV特异性CTL增殖增加（P=0.0023）;（4）与未活化诱导组相比,活化诱导后CD8+T细胞群凋亡敏感性增强（P=0.0004）;与活化诱导后TIGIT-CD8+T细胞组相比,活化诱导后TIGIT+CD8+T细胞群凋亡敏感性增强（P=0.0070）;阻断TIGIT通路,CD8+T细胞凋亡敏感性下降（P=0.0003）;（5）与TIGIT-PD-1-CD8+T细胞相比,慢性HBV感染者TIGIT+PD-1+CD8+T细胞分泌IFN-γ（P<0.001）、IL-2（P<0.001）、TNF-α（P<0.001）所占百分比明显下调;与对照组相比,阻断TIGIT和/或PD-1通路慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多（P<0.001,P<0.001）;与单独阻断TIGIT通路相比,联合阻断TIGIT和PD-1通路组慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多（P<0.001,P<0.001）。结论:（1）表达TIGIT的慢性HBV感染者PBMC中CD8+T细胞和HBV特异性CTL活性增加,其释放效应分子功能受到抑制;（2）TIGIT参与抑制慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌和细胞增殖,使其细胞凋亡敏感性增加;（3）阻断TIGIT通路,慢性HBV感染者HBV特异性CTL分泌细胞因子上调,细胞增殖功能增强,CD8+T细胞凋亡敏感性降低;（4）阻断TIGIT和PD-1通路可逆转耗竭的HBV特异性CTL细胞因子分泌功能。第三部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达与临床指标相关性研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达与临床指标的相关性。方法:收集和分离141例慢性HBV感染者和20例HD外周血血浆和PBMC并冻存。用如下方法检测:（1）全自动生化仪检测谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和转肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase,GGT）等指标;（2）化学发光法检测乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）、HBe Ag滴度等;（3）实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测HBVDNA载量;（4）采用流式细胞术检测:（1）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达;（3）TIGIT在慢性乙型肝炎组、乙肝相关肝硬化组和乙肝肝硬化合并原发性肝癌组和健康者组外周血CD4+和CD8+T细胞表达;（4）TIGIT在接受拉米夫定（lamivudine,LAM）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil,ADV）、替比夫定（Telbivudine,LDT）和恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗和未接受抗病毒治疗慢性HBV感染者外周血CD4+和CD8+T细胞表达。结果:（1）TIGIT在CD4+和CD8+T细胞表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（2）TIGIT在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;PD-1在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（3）TIGIT和PD-1在CD4+和CD8+T细胞共表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（4）与未接受抗病毒治疗组相比,TIGIT在接受四种核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达均下调,有明显统计学差异（P<0.001,P<0.001）,且在ETV组表达最低;（5）随着慢性HBV感染病程进展,TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达呈上升趋势（P<0.001,P<0.001）,且TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞共表达亦呈上升趋势（P<0.001,P<0.001）。结论:（1）在慢性HBV感染者中,乙肝病毒复制和肝脏炎症环境可能诱导TIGIT和PD-1在T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达上调,并随着病情进展TIGIT和PD-1在T细胞的共表达呈上升趋势;（2）四种核苷（酸）类似物抗病毒药物均可抑制TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达。
吴吟[10]（2015）在《腹腔感染时高胆红素血症的机制研究及靶向NLRP3炎症小体的治疗》文中研究说明腹腔感染导致的脓毒症至今仍是危及生命的难题,有着极高的发病率和死亡率。肠瘘导致的腹腔感染是脓毒症的主要原因之一。基于液体复苏、感染源控制和抗生素的传统疗法并不能有效地改善脓毒症病人的预后。发生脓毒症时,肝脏是仅次于肺脏,排列第二位的最容易损伤的器官。在脓毒症的早期,病人即发生高胆红素血症。在肝细胞的胆管面和血窦面有多种转运蛋白。血红蛋白的降解产物形成非结合胆红素,在肝细胞内,它转化为结合胆红素,通过肝细胞的胆小管面分泌到胆汁中,或通过肝细胞的血窦面分泌到血液中。肝脏血流低灌注可能导致缺血性肝炎,从而发生肝功能损伤。作为一种新开发的仪器,激光散斑对比成像仪受到了广泛关注。它可以持续、实时地监测脏器微循环的变化。NLRP3炎症小体（NOD-like receptor family,NLRP3）是一种胞浆内的复合体,剪切IL-1β和IL-18的前体,使它们成为成熟的的炎性因子。IL-1β和IL-18可损伤肝细胞上的转运蛋白。NLRP3炎症小体促进中性粒细胞在脏器中聚集。目前对脓毒症导致的高胆红素血症的机制尚不清楚,脓毒症各阶段的肝脏微循环的变化也未有报道。尚没有文献报道NLRP3炎症小体和脓毒症导致的高胆红素血症的相关性,及潜在的治疗价值。本课题首先通过临床实验,观察在腹腔感染导致的脓毒症病人中,发生高胆红素血症与预后的相关性。接下来,通过大鼠的腹腔感染模型,使用激光散斑对比成像仪,深入研究脓毒症时肝脏微循环血流的动态改变。最后,我们评价了使用短发夹RNA质粒,基因缄默NLRP3炎症小体,对脓毒症导致的高胆红素血症的疗效,为下一步的临床实验提供理论依据。全文共分为如下三部分:第一部分:血清直接胆红素浓度预测肠瘘合并腹腔感染病人的预后目的:本实验的目的是评价持续监测血清直接胆红素的浓度,是否可以预测肠瘘合并腹腔感染病人的预后。方法:这是一项前瞻性的观察实验,纳入2012年1月1日至2013年1月13日收入南京军区南京总医院普通外科的肠瘘合并腹腔感染病人162例,作为推导队列。根据这些病人的28天死亡情况,分为生存组（n=119）和死亡组（n=43）。监测病人入院当天及入院第3、7天的各项生化指标。DB0的定义是入院当天的血清直接胆红素浓度,△DB3的定义是入院第3天的血清直接胆红素浓度与入院当天的血清直接胆红素浓度的差值。该定义也适用于其他指标。使用ROC曲线分析各生化指标预测病人预后的敏感度和特异度。同时,纳入2013年1月14日至2013年10月16日收入我科的116例病人作为验证队列,再次检验从推导队列鉴别出的有价值的预测指标。结果:与生存组相比,死亡组病人的DB7显着升高（23.1±10.6 vs.11.2±1.1,P<0.001）,第7天的降钙素原浓度PCT7也显着升高（5.2±2.8 vs.1.7±0.3 P=0.006）。ROC曲线分析表明,DB7>12.8 μmol/L或ΔDB7>7.3 μmol/L可准确地预测病人的28天死亡情况（DB7:敏感度86.4%,特异度88.6%,（ROC曲线下面积AUC）:0.881,P<0.001;ΔDB7:敏感度 84.4%,特异度 85.1%,AUC:0.865,P<0.001）。联合多个指标预测的准确度最高:（DB7>12.8 μmol/L+ΔPCT7<5.3 ng/m）（AUC:0.894,P<0.001）。这些指标的预测价值在验证队列中再次被证实。结论:持续监测血清直接胆红素的浓度,可预测肠瘘合并腹腔感染病人的28天死亡情况,直接胆红素升高和胆红素浓度波动幅度过大是敏感的预警指标,应该在危重症病人的临床监护中加以重视。第二部分:激光散斑对比成像仪监测脓毒症时的肝脏微循环目的:脓毒症是一种由严重感染导致的致命的系统性炎症反应。本实验的目的是使用激光散斑对比成像仪（Laser speckle contrast imaging,LSCI）,监测脓毒症时肝脏的微循环变化,同时研究导致肝脏微循环障碍的机制。方法:使用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）的方法制作大鼠的脓毒症模型。大鼠被分为假手术组和脓毒症组,使用激光散斑对比成像仪监测实验过程中大鼠的肝脏的微循环变化。同时,比较这两组大鼠的肝脏内皮细胞功能（细胞间粘附分子的含量、凝血功能和血管通透性）,肝脏中的中性粒细胞聚集情况等。结果:脓毒症时,肝脏的微循环障碍逐渐加重（初始时290.3±70.1 LSPU（激光散斑对比成像仪测得的血流灌注单位）vs.脓毒症后12小时:230.4 ± 60.7 LSPU vs.脓毒症后48小时:125.2±25.4 LSPU,P<0.001）。脓毒症发生后6小时,大鼠发生高胆红素血症。在脓毒症的早期,肝脏中的中性粒细胞聚集不断增加,血管内的微血栓阻塞情况也越来越严重。在脓毒症的晚期,肝脏中的中性粒细胞聚集已达到峰值。同时,内皮细胞的凝血功能从促凝状态转为抗凝状态。脓毒症后12h,肝脏血管通透性增加,也是肝脏微循环功能的障碍的发生原因之一。结论:脓毒症的早期,就发生了肝脏微循环障碍,导致了肝功能损伤。肝脏微循环障碍的原因包括中性粒细胞和内皮细胞的相互作用,血窦内微血栓的形成和肝脏血管通透性的增加。第三部分:基因缄默NLRP3炎症小体治疗脓毒症导致的高胆红素血症和高胆酸血症目的:NOD样受体家族（NLRP3）炎症小体在很多炎症疾病中起到重要的作用。但NLRP3炎症小体和脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症的关系尚不明确。我们的目的是验证,通过基因缄默NLRP3炎症小体是否可以治疗脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症。方法:使用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）的方法制作大鼠的脓毒症模型。在术前48小时,通过尾静脉注射NLRP3的短发夹RNA质粒（NLRP3 shRNA,NLRP3 short hairpin RNA plasmids）。大鼠被分为 4 组,组 1:假手术组;组2:脓毒症组;组3:注射NLRP3的短发夹RNA质粒后再造模脓毒症组(在本文中被称为“NLRP3的短发夹RNA质粒组”;组4:注射无意义序列的短发夹RNA质粒后再造模脓毒症组（在本文中被称为“无意义序列的短发夹RNA质粒组”）。设置术后0小时、6小时、12小时、24小时和48小时为取材的时间点,共5个时间点,在各个时间点测定大鼠血清中的胆酸浓度和胆红素浓度,肝脏中的肝细胞表面转运蛋白的mRNA水平和蛋白水平,肝脏中的炎性细胞因子的含量和各种炎性细胞的特性,并比较各个组的变化情况。结果:脓毒症后,肝脏中NLRP3的mRNA水平和蛋白水平都显着上升,但使用NLRP3的短发夹RNA质粒预治疗后,NLRP3的mRNA水平和蛋白水平的表达被抑制。和脓毒症组的大鼠以及无意义序列的短发夹RNA质粒组的大鼠相比,NLRP3的短发夹RNA质粒组的大鼠的血清中甘氨酸-结合胆酸的浓度显着下降,血清中牛磺酸-结合胆酸的浓度显着下降,血清中结合胆红素的浓度也显着下降。肝细胞的转运蛋白的表达水平得以恢复,肝脏中的炎性细胞因子的浓度下降,肝脏中聚集的中性粒细胞数量减少,巨噬细胞发生炎性凋亡的比例减少。结论:基因缄默NLRP3炎症小体可治疗脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症,治疗的机制是通过恢复肝细胞的转运蛋白的表达水平,减少肝脏中的炎性细胞因子的浓度、肝脏中聚集的中性粒细胞数量和巨噬细胞发生炎性凋亡的比例。NLRP3炎症小体可能是治疗脓毒症的一个重要靶点。
二、慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义（论文提纲范文）
（1）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 IL-26 促进HBV-Tg转基因小鼠肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第二章 IL-26诱导肝星状细胞的增殖和活化促进肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第三章 IL-26 通过调控TGF-β1/Smad2 信号通路促进肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、设备、材料及试剂 |
| 三、方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 白细胞介素在肝纤维化过程中的作用及分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 急性肝功能衰竭的急诊临床管理的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.类风湿关节炎 |
| 1.1 疾病介绍 |
| 1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
| 1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
| 2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
| 2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
| 2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
| 2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
| 3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路 |
| 3.2 基本过程及调节 |
| 3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
| 4.川陈皮素药理性作用 |
| 4.1 名称介绍 |
| 4.2 药代动力学 |
| 4.3 药理作用 |
| 5.本研究的目的和内容 |
| 第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验过程 |
| 1.4 实验分析 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
| 2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
| 2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
| 2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
| 2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
| 2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验试剂配置 |
| 1.4 实验过程 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 模型成功率检测 |
| 2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
| 2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
| 2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
| 2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（5）柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 柳胺酚代谢产物鉴定及代谢通路研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 配置柳胺酚溶液 |
| 3.2 动物实验方案 |
| 3.3 体内代谢产物样品的收集与处理 |
| 3.4 体外代谢产物的制备 |
| 3.5 色谱与质谱条件 |
| 3.6 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 柳胺酚母离子分析 |
| 4.2 柳胺酚代谢产物鉴定 |
| 4.3 柳胺酚肝脏药物代谢酶亚型鉴定 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二部分 柳胺酚代谢产物抗HBV活性研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 RRM2活性位点与柳胺酚及其代谢产物分子对接 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖毒性测定 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 细胞水平抗乙肝病毒活性测定 |
| 3.6 柳胺酚羟基化代谢产物与核苷(酸)类似物联合效应测定 |
| 3.7 数据处理 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 RRM2分子活性位点定义 |
| 4.2 柳胺酚及其代谢产物与RRM2分子对接结果 |
| 4.3 LAF-OH对细胞增殖毒性影响的研究 |
| 4.4 LAF-OH对细胞凋亡影响的研究 |
| 4.5 LAF-OH抗HBV活性研究 |
| 4.6 LAF-OH与核苷(酸)类似物联合用药研究 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第三部分 柳胺酚活性代谢物LAF-OH抗HBV机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.试剂与仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 细胞株及载体 |
| 2.3 仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 细胞内RRM2活性检测 |
| 3.4 LAF-OH处理后细胞内RRM1、RRM2、RRM2B在mRNA及蛋白水平的表达检测 |
| 3.5 iTRAQ标记定量蛋白组分析方法 |
| 3.6 细胞周期检测方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 LAF-OH对细胞周期及IL-17、PPAR等信号通路产生调控 |
| 4.2 LAF-OH通过降低Akt的磷酸化水平下调cyclin D1表达水平 |
| 4.3 LAF-OH在mRNA水平及蛋白质水平抑制RRM2的表达 |
| 4.4 LAF-OH对RR活性具有抑制作用 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）母体孕晚期外周血细胞因子和TLR9在HBV宫内传播中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 细胞因子在HBV宫内传播与儿童乙肝疫苗应答的研究进展 |
| 第二部分 Toll样受体在HBV宫内传播的研究进展 |
| 第一部分 母体孕晚期Th1细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 母体孕晚期Th2细胞因子与子代HBV宫内传播的流行病学研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 母体孕晚期TLR9 在子代HBV宫内传播中的作用研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 母体孕晚期细胞因子及TLR9表达与其幼儿预后的队列研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌中作用机制的研究 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附图表 |
| 七 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA SNHG3通过NLRP3影响慢加急性乙型肝炎肝衰竭预后 |
| 一 前言 |
| 二 材料与方法 |
| 三 结果 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 附表图 |
| 七 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（8）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文专用缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.引言 |
| 2.T细胞介导的抗病毒反应 |
| 3.慢性病毒感染过程中抑制性受体在耗竭的CD8+T 细胞表达上调 |
| 4.TIGIT和 PD-1 的分子结构特点、表达、参与免疫调节及在慢性病毒感染中的作用 |
| 4.1 TIGIT |
| 4.2 PD-1 |
| 5.共抑制性受体的协同作用 |
| 6.慢性病毒感染中抑制性受体表达的转录调控 |
| 6.1 NFAT |
| 6.2 Blimp-1 |
| 6.3 T-bet |
| 6.4 T-box |
| 6.5 FoxO1 |
| 7.小结和展望 |
| 第一部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达的研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1. TIGIT在慢性HBV感染者和健康者外周血T细胞表达 |
| 2.TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞分化亚群各阶段表达 |
| 3. TIGIT和PD-1 在慢性HBV感染者外周血T细胞表达 |
| 4. HLA-A*0201 限制性表位肽/五聚体复合物流式细胞术检测HBV特异性CTL |
| 5. TIGIT和PD-1 在慢性HBV感染者外周血HBVcore特异性CTL表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞中的功能研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.慢性HBV感染者CD8+T细胞及HBV特异性CTL上CD69 的表达和Granzyme B、Perforin的分泌 |
| 2.慢性HBV感染者HBV特异性CTL细胞因子的分泌 |
| 3.慢性HBV感染者外周血特异性CTL增殖的检测 |
| 4.慢性HBV感染者CD8+T细胞凋亡敏感性 |
| 5.TIGIT和PD-1 共表达对慢性HBV感染者T细胞分泌细胞因子影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达与临床指标相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1. TIGIT在慢性HBV感染者T细胞的表达与临床指标的相关性 |
| 2. TIGIT在四种核苷(酸)类似物治疗的慢性HBV感染者T细胞表达情况 |
| 3. TIGIT在慢性HBV感染者不同疾病进展阶段外周血T细胞表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 博士期间以第一作者发表文章目录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）腹腔感染时高胆红素血症的机制研究及靶向NLRP3炎症小体的治疗（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 临床实验线路图 |
| 动物实验线路图 |
| 第一部分 血清直接胆红素浓度预测肠瘘合并腹腔感染病人的预后：一项病例对照研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 激光散斑对比成像仪监测脓毒症时的肝脏微循环一种可以早期发现微循环障碍的仪器 |
| 前言 |
| 实验动物与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 动物实验 基因缄默NLRP3炎症小体治疗脓毒症导致的高胆红素血症 |
| 前言 |
| 实验动物与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述部分 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 博士期间完成文章 |
| 致谢 |
| 附件一：课题代表文章 |
四、慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义（论文参考文献）
- [1]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [3]IL-26通过调控TGF-β1/Smad2信号通路介导肝星状细胞的增殖和活化而促进肝纤维化[D]. 张新奇. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [4]川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究[D]. 刘中兵. 苏州大学, 2020(06)
- [5]柳胺酚代谢产物鉴定及活性代谢物抗乙型肝炎病毒活性与机制研究[D]. 武喆. 浙江大学, 2020(01)
- [6]母体孕晚期外周血细胞因子和TLR9在HBV宫内传播中的作用研究[D]. 王海荣. 中国人民解放军空军军医大学, 2020
- [7]长链非编码RNA SNHG3在肝细胞肝癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的研究[D]. 赵倩. 山东大学, 2020(09)
- [8]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究[D]. 魏艳艳. 东南大学, 2019(05)
- [10]腹腔感染时高胆红素血症的机制研究及靶向NLRP3炎症小体的治疗[D]. 吴吟. 南京大学, 2015(01)